ATN-224

ATN-224 是一种Cu2+/Zn2+-超氧化物歧化酶 1 (SOD1) 抑制剂。ATN-224 作用内皮细胞,抑制抑制SOD1活性,IC50 为 17.5±3.7 nM。

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IC50: 17.5±3.7 nM (SOD1, in endothelial cells)[1]

ATN-224对铜离子(108 mol/L-1)具有特异性和高亲和力,并且通过等温滴定量热法测定,在浓度高达1 mM时不显示与钙,铁,镁,锌或锰离子的结合。 ATN-224抑制HUVEC的增殖(IC50 = 1.4±0.3μM; n = 5)。在孵育24小时后,ATN-224还能够抑制纯化的牛SOD1的活性,IC50为0.33±0.03μM。 ATN-224的SOD1抑制是时间依赖性的,在~16小时达到最大抑制。 ATN-224似乎通过耗尽铜酶来抑制SOD1。 ATN-224能够抑制内皮细胞中的SOD1活性,这种作用是剂量依赖性的,IC50为17.5±3.7nM。 ATN-224以剂量依赖性和时间依赖性方式抑制FGF-2诱导的ERK1/2磷酸化,IC50在1.25和2.5μM之间,与抑制增殖的IC50一致[1]。 ATN-224是一种口服可用的无机小分子,可抑制内皮细胞和肿瘤细胞中铜/锌依赖性酶,超氧化物歧化酶1(Cu/Zn-SOD1)[2]。

ATN-224也显着(P <0.05)抑制小鼠Matrigel栓模型中的血管生成,或者当直接添加到栓塞中时或通过口服强饲法给予时。当通过口服管饲法给予ATN-224时血管生成的抑制发生在血浆或来自基质胶塞的铜中可测量的铜耗尽之前。该结果表明ATN-224抑制血管生成而不依赖于铜耗尽[1]。

将细胞以六孔格式（每孔100-300,000）接种，并与指定浓度的ATN-224一起孵育指定的时间。然后用10ng / mL FGF-2刺激细胞不同时间并裂解。使用对磷酸化的p44 / 42促分裂原活化蛋白激酶（Thr202 / Tyr204）特异性的抗体对裂解物进行蛋白质印迹分析，并使用对p44 / 42促分裂原活化蛋白激酶特异性的抗体进行适当的信号校正[1]。

人脐静脉内皮细胞（HUVEC）维持在M200 / LSGS培养基中，细胞用于所有实验的第2代和第4代之间。对于增殖测定，将细胞以每孔3,000个接种在M200 / 2％FBS中的0.1％明胶上4小时，然后在存在或不存在ATN-224的情况下用2ng / mL FGF-2刺激直至48小时。使用Alamar Blue或MTT测定法测定HUVEC增殖。多发性骨髓瘤MM1S细胞在含有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中生长。将HL-60早幼粒细胞白血病细胞和MOLT-4急性成髓细胞白血病细胞以400,000 / mL接种在T-75烧瓶中，并孵育48至96小时用于增殖测定。使用钙黄绿素AM测定MMS1细胞增殖[1]。

将小鼠[1]冷基质胶（500μL）与800ng / mL FGF-2或300ng / mL VEGF和肝素（50μg/ mL）混合。阴性对照栓塞不含促血管生成因子。将Matrigel混合物皮下注射到4至8周龄的雌性BALB / c裸鼠中。在一些实验中，将具有或不具有Mn-TBAP（100μM）的ATN-224（94μM）或水分别直接添加至处理组和阴性对照组中的基质胶塞。或者，每周一至周五，每天用蒸馏水或ATN-224口服管饲小鼠。处死动物并在塞子注射后5天回收塞子。然后将塞子切碎并用组织匀浆器均化，并使用Drabkin溶液测定塞子中的血红蛋白水平。

[1]. Juarez JC, et al. Copper binding by tetrathiomolybdate attenuates angiogenesis and tumor cell proliferation through the inhibition of superoxide dismutase 1. Clin Cancer Res. 2006 Aug 15;12(16):4974-82.

[2]. Lin J, et al. A non-comparative randomized phase II study of 2 doses of ATN-224, a copper/zinc superoxide dismutase inhibitor, in patients with biochemically recurrent hormone-naïve prostate cancer. Urol Oncol. 2013 Jul;31(5):581-8.

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