陶扎色替_作用_生物活性_实验方法
发布时间：2018-10-25 14:26:43 编辑作者：活性达人
图片：陶扎色替结构式
陶扎色替是一种泛极光抑制剂，在无细胞试验中主要针对Aurora A（Kiapp：0.6 nM），对Aurora B / C效果较差，Aurora A选择性提高100倍。 超过55种其他激酶。
一、陶扎色替的生物活性详解：
1）体外活性
陶扎色替诱导相似的细胞毒性，IC50约为300nM，并且在用ABL或FLT-3（突变型和野生型）激酶转染的BaF3细胞中表现出G2 / M阻滞，核内复制和凋亡的AUR B样抑制表型。 陶扎色替以时间依赖性方式阻止CAL-62增殖。 陶扎色替处理14天显着降低了菌落的数量和大小，在8305C中降低了约70％，在CAL-62,8505C和BHT-101中降低了90％。用陶扎色替处理不同的ATC细胞抑制增殖，IC50在25和150nM之间。 陶扎色替显着损害不同细胞系在软琼脂中形成菌落的能力。对胱天蛋白酶-3活性的分析表明陶扎色替诱导不同细胞系中的细胞凋亡。暴露于陶扎色替 12小时的CAL-62细胞显示DNA含量≥4N的细胞积累。延时分析表明陶扎色替处理的CAL-62细胞在不分裂的情况下退出中期。此外，陶扎色替治疗后组蛋白H3磷酸化被废除[2]。 陶扎色替对患者来源样本中携带T315I突变的BCR-Abl具有显着的抑制活性[3]。
2）体内活性
陶扎色替（2 mg/kg/h）的效果明显更高，比实验前的初始肿瘤平均尺寸下降56%。通过比较顺铂，每四天腹腔注射一次 陶扎色替（5.4 mg/kg）给药，共三次，抑制肿瘤生长只达9%。 陶扎色替（12.5 mg/kg，2次/天）可剂量依赖性地显著降低肿瘤生长。每天给药实验鼠两次 陶扎色替（75 mg/kg，i.p.），持续13天，与对照组相比，平均肿瘤体积减少98%。陶扎色替耐受性良好，仅高剂量时会使实验动物体重稍微降低。陶扎色替可使人AML(HL-60)移植瘤模型的肿瘤尺寸显著降低。在胰脏和结肠移植瘤中，陶扎色替也使肿瘤衰退。在携带HCT116肿瘤的实验鼠中，陶扎色替（i.v）给药具有很强的抗癌活性。
二、陶扎色替的实验方法：
1）动物实验
对于HL-60研究，将雌性无胸腺NCr-nu小鼠皮下接种107个HL-60（TB）白血病细胞到右腋窝区域。腹膜内给药治疗。肿瘤达到150-200 mm3后。 陶扎色替在50％PEG 300的50mM磷酸盐缓冲液载体中制备。用盐水配制的顺铂腹膜内给药。 q.4.d.总共三次注射，剂量为5.4 mg / kg。对于MIA PaCa-2研究，将雌性MF1裸鼠用107个MIA PaCa-2细胞接种到背侧。腹膜内给药治疗。肿瘤达到175 mm3后。 陶扎色替在50％PEG 300的50mM磷酸盐缓冲液载体中制备。用盐水配制的5-氟尿嘧啶静脉内给药。 q.4.d.剂量为50毫克/千克。对于HCT116研究，将雌性Hsd RH rnu / nu大鼠用107个HCT116细胞接种到右胁腹。一旦肿瘤达到700-950mm 3，就进行治疗。 陶扎色替通过留置的股动脉导管连续给药，然后在重复给药周期之前用盐水输注4天。对于所有研究，肿瘤体积通过卡尺测量每周三次测定。
2）细胞实验
在不存在（二甲基亚砜，DMSO）或存在500nM 陶扎色替的情况下培养CAL-62细胞不同的时间段（1-5天）。 通过用不同浓度的Aurora抑制剂（5-500nM）处理不同的ATC细胞4天来评估陶扎色替对细胞增殖的剂量依赖性作用。 在孵育时间结束之前，将细胞用30mM BrdU脉冲标记2小时。 使用细胞增殖ELISA试剂盒通过比色免疫测定法分析BrdU掺入。 将来自陶扎色替处理的细胞的结果与在对照细胞中观察到的结果进行比较，并表示为相对于对照的变异倍数。
3）激酶实验
ATP的消耗通过丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶对与NADH的氧化偶联，可以通过340nm处的吸收减少来监测。 反应包含100 mM Tris（pH 8），10 mM MgCl 2,2.2 mM ATP，1 mM磷酸烯醇丙酮酸，0.6 mg / mL NADH，75单位/ mL丙酮酸激酶，105单位/ mL乳酸脱氢酶和0.5 mM底物肽（序列：EAIYAAPFAKKK）。 通过添加足够的激酶使反应达到30nM激酶浓度来开始反应（75μL），并且在微量滴定板分光光度计中在30℃下在30分钟内监测吸光度的降低。 通过在100％DMSO或单独的DMSO中添加3.75μL陶扎色替获得抑制常数。 Ki值如下计算，Ki = IC 50 /（1+ [S] / Kd），其中[S] = [ATP] = 2.2mM，Kd（ATP至Abl）=70μM。 假设野生型和H396P Abl激酶结构域的Kd（ATP）为70μM，计算这些值。
综上所述：陶扎色替是一种 Aurora-A，Aurora-B，Aurora-C 抑制剂，Ki 值为 0.6，18，4.6 nM。它的靶点活性为Aurora A,0.6nM(Kiapp)；Aurora B,18nM(Kiapp)；Aurora C,4.6nM(Kiapp)；Bcr-Abl,30nM(Ki)；FLT3,30nM(Ki)。
参考文献：
[1]. Harrington EA, et al. VX-680, a potent and selective smallmolecule inhibitor of the Aurora kinases, suppresses tumor growth in vivo. Nat Med. 2004; 10:262-7.
[2]. Salah E, et al. Crystal structures of ABL-related gene (ABL2) in complex with imatinib, tozasertib (VX-680), and a type I inhibitor of the triazole carbothioamide class.J Med Chem. 2011 Apr 14;54(7):2359-67. Epub 2011 Mar 18.
[3]. Arlot-Bonnemains Y, et al. Effects of the Aurora kinase inhibitor VX-680 on anaplastic thyroid cancer-derived cell lines. Endocr Relat Cancer. 2008 Jun;15(2):559-68.
一、陶扎色替的生物活性详解：
1）体外活性
陶扎色替诱导相似的细胞毒性，IC50约为300nM，并且在用ABL或FLT-3（突变型和野生型）激酶转染的BaF3细胞中表现出G2 / M阻滞，核内复制和凋亡的AUR B样抑制表型。 陶扎色替以时间依赖性方式阻止CAL-62增殖。 陶扎色替处理14天显着降低了菌落的数量和大小，在8305C中降低了约70％，在CAL-62,8505C和BHT-101中降低了90％。用陶扎色替处理不同的ATC细胞抑制增殖，IC50在25和150nM之间。 陶扎色替显着损害不同细胞系在软琼脂中形成菌落的能力。对胱天蛋白酶-3活性的分析表明陶扎色替诱导不同细胞系中的细胞凋亡。暴露于陶扎色替 12小时的CAL-62细胞显示DNA含量≥4N的细胞积累。延时分析表明陶扎色替处理的CAL-62细胞在不分裂的情况下退出中期。此外，陶扎色替治疗后组蛋白H3磷酸化被废除[2]。 陶扎色替对患者来源样本中携带T315I突变的BCR-Abl具有显着的抑制活性[3]。
2）体内活性
陶扎色替（2 mg/kg/h）的效果明显更高，比实验前的初始肿瘤平均尺寸下降56%。通过比较顺铂，每四天腹腔注射一次 陶扎色替（5.4 mg/kg）给药，共三次，抑制肿瘤生长只达9%。 陶扎色替（12.5 mg/kg，2次/天）可剂量依赖性地显著降低肿瘤生长。每天给药实验鼠两次 陶扎色替（75 mg/kg，i.p.），持续13天，与对照组相比，平均肿瘤体积减少98%。陶扎色替耐受性良好，仅高剂量时会使实验动物体重稍微降低。陶扎色替可使人AML(HL-60)移植瘤模型的肿瘤尺寸显著降低。在胰脏和结肠移植瘤中，陶扎色替也使肿瘤衰退。在携带HCT116肿瘤的实验鼠中，陶扎色替（i.v）给药具有很强的抗癌活性。
二、陶扎色替的实验方法：
1）动物实验
对于HL-60研究，将雌性无胸腺NCr-nu小鼠皮下接种107个HL-60（TB）白血病细胞到右腋窝区域。腹膜内给药治疗。肿瘤达到150-200 mm3后。 陶扎色替在50％PEG 300的50mM磷酸盐缓冲液载体中制备。用盐水配制的顺铂腹膜内给药。 q.4.d.总共三次注射，剂量为5.4 mg / kg。对于MIA PaCa-2研究，将雌性MF1裸鼠用107个MIA PaCa-2细胞接种到背侧。腹膜内给药治疗。肿瘤达到175 mm3后。 陶扎色替在50％PEG 300的50mM磷酸盐缓冲液载体中制备。用盐水配制的5-氟尿嘧啶静脉内给药。 q.4.d.剂量为50毫克/千克。对于HCT116研究，将雌性Hsd RH rnu / nu大鼠用107个HCT116细胞接种到右胁腹。一旦肿瘤达到700-950mm 3，就进行治疗。 陶扎色替通过留置的股动脉导管连续给药，然后在重复给药周期之前用盐水输注4天。对于所有研究，肿瘤体积通过卡尺测量每周三次测定。
2）细胞实验
在不存在（二甲基亚砜，DMSO）或存在500nM 陶扎色替的情况下培养CAL-62细胞不同的时间段（1-5天）。 通过用不同浓度的Aurora抑制剂（5-500nM）处理不同的ATC细胞4天来评估陶扎色替对细胞增殖的剂量依赖性作用。 在孵育时间结束之前，将细胞用30mM BrdU脉冲标记2小时。 使用细胞增殖ELISA试剂盒通过比色免疫测定法分析BrdU掺入。 将来自陶扎色替处理的细胞的结果与在对照细胞中观察到的结果进行比较，并表示为相对于对照的变异倍数。
3）激酶实验
ATP的消耗通过丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶对与NADH的氧化偶联，可以通过340nm处的吸收减少来监测。 反应包含100 mM Tris（pH 8），10 mM MgCl 2,2.2 mM ATP，1 mM磷酸烯醇丙酮酸，0.6 mg / mL NADH，75单位/ mL丙酮酸激酶，105单位/ mL乳酸脱氢酶和0.5 mM底物肽（序列：EAIYAAPFAKKK）。 通过添加足够的激酶使反应达到30nM激酶浓度来开始反应（75μL），并且在微量滴定板分光光度计中在30℃下在30分钟内监测吸光度的降低。 通过在100％DMSO或单独的DMSO中添加3.75μL陶扎色替获得抑制常数。 Ki值如下计算，Ki = IC 50 /（1+ [S] / Kd），其中[S] = [ATP] = 2.2mM，Kd（ATP至Abl）=70μM。 假设野生型和H396P Abl激酶结构域的Kd（ATP）为70μM，计算这些值。
综上所述：陶扎色替是一种 Aurora-A，Aurora-B，Aurora-C 抑制剂，Ki 值为 0.6，18，4.6 nM。它的靶点活性为Aurora A,0.6nM(Kiapp)；Aurora B,18nM(Kiapp)；Aurora C,4.6nM(Kiapp)；Bcr-Abl,30nM(Ki)；FLT3,30nM(Ki)。
参考文献：
[1]. Harrington EA, et al. VX-680, a potent and selective smallmolecule inhibitor of the Aurora kinases, suppresses tumor growth in vivo. Nat Med. 2004; 10:262-7.
[2]. Salah E, et al. Crystal structures of ABL-related gene (ABL2) in complex with imatinib, tozasertib (VX-680), and a type I inhibitor of the triazole carbothioamide class.J Med Chem. 2011 Apr 14;54(7):2359-67. Epub 2011 Mar 18.
[3]. Arlot-Bonnemains Y, et al. Effects of the Aurora kinase inhibitor VX-680 on anaplastic thyroid cancer-derived cell lines. Endocr Relat Cancer. 2008 Jun;15(2):559-68.
相关化合物：陶扎色替