Furimazine

Furimazine 是一种咪唑并吡嗪酮类的发光底物。在哺乳动物细胞中, NanoLuc (Nluc) 与 Furimazine 联用,产生更亮的发光,比带 Coelenterazine 的 Oluc-19 高 250 万倍。

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染料试剂

Furimazine是一种Coelenterazine类似物。使用腔肠素类似物或Coelenterazine的纯化NanoLuc(Nluc)的表观Km约为10μM,而腔肠素类似物的最大发光(即表观Vmax)比天然Coelenterazine高约30倍。从表达Nluc的细胞测量发光强度表明,在约10-20μM的腔肠素类似物中获得最大信号[1]。

通过易错PCR（每个克隆平均2-3个突变）产生随机文库。用Coelenterazine筛选文库1（第1阶段;模板= Oluc-N166R）（4,400种变体）。用2种新的Coelenterazine类似物筛选文库2（第2阶段;模板= C1A4E）（4,400种变体）：3840,3841,3842,3857,3888,3881,3886,3887,3889,3897和3900.11种类似物代表取代在第2,6和8位，被认为是整个24种化合物的代表;用化合物3896和3894筛选2,200种变体。用剩余的Coelenterazine类似物再次筛选所有命中物（改善的发光）。使用Coelenterazine和腔肠素类似物在小鼠Id-X-HaloTag（其中X =文库）的背景下筛选文库3（第3阶段;模板= C1A4E + Q18L / K33N / F54I / F68Y / L72Q / M75K / I90V）。图书馆屏幕在Freedom机器人工作站上进行如下：诱导细菌培养（在96孔微量滴定板中）用含有300mM HEPES pH 8,200mM硫脲，0.3X被动裂解缓冲液，0.3mg / mL溶菌酶的缓冲液裂解。和0.002单位的RQ1 DNase。然后将含有1mM CDTA，150mM KCl，10mM DTT，0.5％（v / v）Tergitol和20μM底物的测定试剂加入等体积的裂解物中。样品在GENios Pro光度计[1]上测量。

[1]. Hall MP, et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem Biol. 2012 Nov 16;7(11):1848-57.

磺丁基-β-环糊精钠盐 | 环孢霉素A | 2-(3,6-二乙酰氧基-2,7-二氯-9H-氧杂蒽-9-基)苯甲酸 | 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐 | GW4869 | 乙莫克舍 | (2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6S,6'S)-6,6'-硫代双(4-(4-(3-氟苯基)-1H-1,-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-3,5-二醇) | Mitoquinone甲磺酸盐 | GSK2795039 | CBIC2 | BAPTA-AM | AP20187 | GKT137831 | D-(-)-荧光素 | 单响尾蛇毒蛋白