AMG319

AMG319 是一种有效的选择性 PI3Kδ 抑制剂,IC50 为 18 nM。

研究领域 >> 癌症

PI3Kδ:18 nM (IC50)

PI3Kγ:850 nM (IC50)

PI3Kβ:2.7 μM (IC50)

PI3Kα:33 μM (IC50)

AMG319抑制PI3Kδ,PI3Kγ,PI3Kβ和PI3Kα,IC50分别为18 nM,850 nM,2.7μM和33μM。 AMG319,一种在人全血检测(HWB)中IC50为16 nM的化合物,对大量蛋白激酶具有出色的选择性,并且通过两种啮齿动物疾病模型测定的高水平体内功效。 AMG319具有最小的CYP3A4/2D6抑制并且不抑制CYP(1A2,2C8,2C9,2C19,2E1,全部>20μM)。如在肝细胞中测量的,对CYP 3A4,2D6,1A2和2C9没有时间依赖性抑制(TDI),也没有CYP诱导(3A4,2D6,1A2,2B6)。 AMG319在hERG结合试验(>25μM)中是清洁的,并且Ames微核试验证明是阴性的。 AMG319在BSEP测定中具有最小>200μM的最小效应。此外,AMG319在大型副作用分析组(CEREP)中是清洁的,并且在以10μM药物浓度测试的大量359种独特蛋白激酶组中没有活性[1]。

进行该研究以确定生物化学覆盖(即pAKT)与体内功能活性之间的相关性。 AMG319在3 mg/kg水平下实现了这一覆盖率,这也是人类全血分析(HWB)(CD-69)IC90在低谷中整个24小时。较低剂量0.1,0.3和1mg/kg涵盖HWB IC50和IC90之间的谷浓度,并显示部分功效。类似地,AMG319的血浆浓度覆盖了1mg/kg剂量的小鼠抗IgM pAKT体外试验中的IC90 [1]。

PI3K Alphascreen测定法用于测量一组四种磷酸肌醇3-激酶：PI3Kα，PI3Kβ，PI3Kγ和PI3Kδ的活性。使用无菌水和50mM Tris-HCl，pH 7,14mM MgCl 2,2mM胆酸钠和100mM NaCl制备酶反应缓冲液。在实验当天新鲜加入2mM DTT。使用无菌水和10mM Tris-HCl，pH 7.5,150mM NaCl，0.10％吐温20和30mM EDTA制备Alphascreen缓冲液。然后在实验当天新鲜加入1mM DTT。用于该测定的化合物源板是384孔Greiner透明聚丙烯板，其含有5mM的测试化合物并且在22个浓度下以1：2稀释。第23和24列仅含有DMSO，因为这些孔分别包含阳性和阴性对照。通过将每孔0.5μL转移到384孔Optiplates中来复制源板。将每种PI3K同种型在酶反应缓冲液中稀释至2x工作原液。将PI3Kα稀释至1.6nM，将PI3Kβ稀释至0.8nM，将PI3Kγ稀释至15nM，并将PI3Kδ稀释至1.6nM。将PI（4,5）P2稀释至10μM，并将ATP稀释至20μM。该2x原液用于PI3Kα和PI3Kβ的测定。为了测定PI3Kγ和PI3Kδ，将PI（4,5）P2稀释至10μM并将ATP稀释至8μM以制备类似的2x工作原液。使用来自抗GST Alphascreen试剂盒的珠子制备Alphascreen反应溶液。 Alphascreen试剂的两个4x工作原料在Alphascreen反应缓冲液中制备。在一种原液中，将生物素化的-IP4稀释至40nM，并将链霉抗生物素蛋白供体珠稀释至80μg/ mL。在第二种原液中，将PIP3结合蛋白稀释至40nM，并将抗GST-受体珠稀释至80μg/ mL。将板在室温下孵育30分钟。仍然在黑暗中，将10μL/孔的受体珠溶液添加到板的柱1-24中。然后将板在黑暗中温育1.5小时。使用680nm激发滤光片和520-620nm发射滤光片[1]在Envision多模板读数器上读板。

通过阴性选择从人外周血单核细胞（PBMC）中纯化B细胞。将每孔约3×104个纯化的B细胞接种到96孔板中。将化合物（例如，AMG319）以10mM的浓度溶解在DMSO中，并在DMSO中进行化合物的10点，3倍连续稀释。然后将0.5μL化合物一式两份加入每个孔中，使得最终DMSO浓度为0.25％，最高化合物浓度为10μM。预孵育30分钟后，用2μg/ mL抗人IgM抗体加300ng / mL人CD40L或5ng / mL人IL-4加200ng / mL CD40L作为反选筛选处理B细胞以评价脱靶效应。将板在37℃和5％CO 2下孵育72小时，然后用0.5μCi/孔3H胸苷脉冲18小时，收集B细胞以计数3H胸苷的掺入[1]。

小鼠[1] IgM膜仅纯合转基因小鼠（6至12周龄雌性）口服给予AMG319或载体对照（每组n = 5）。在处理后15分钟，给小鼠尾静脉内注射50μg无内毒素的FITC标记的μ链特异性抗IgM或仅PBS对照。刺激30分钟后收集血液和脾脏组织用于药物浓度和通过流式细胞术进行B细胞pAKT分析。简而言之，用BD Phosflow裂解/固定缓冲液固定血液和分散的脾细胞，沉淀，并用冷的90％MeOH透化。然后用pAKT和Alexa-647二级和B220-太平洋蓝染色细胞用于FACS分析。用来自作为对照的抗IgM未处理小鼠的B220 + / FITC-B细胞分析刺激的B220 + /抗IgM FITC + B细胞的pAKT水平。维持小鼠并进行实验。大鼠[1]雌性Lewis大鼠（N = 8 /剂量组）每天一次用AMG319或媒介物（2％HPMC，1％Pluronic F68,10％Captisol，pH2.0）以不同剂量给药10天。第一次给药后2小时，静脉内给每只大鼠施用200μL含有60μgKLH的PBS。在KLH引发后10天，对大鼠实施安乐死并通过心脏穿刺取血以通过ELISA测量KLH特异性IgG和IgM。

[1]. Cushing TD, et al. Discovery and in vivo evaluation of (S)-N-(1-(7-fluoro-2-(pyridin-2-yl)quinolin-3-yl)ethyl)-9H-purin-6-amine (AMG319) and related PI3Kδ inhibitors for inflammation and autoimmune disease. J Med Chem. 2015 Jan 8;58(1):480-511.

3-甲基腺嘌呤 | LY294002 | 渥曼青霉素 | Alpelisib (BYL719) | 5-[2,6-二(4-吗啉基)-4-嘧啶基]-4-(三氟甲基)-2-吡啶胺 | IPI549 | 2-氨基-N-[2,3-二氢-7-甲氧基-8-[3-(4-吗啉基)丙氧基]咪唑并[1,2-c]喹唑啉-5-基]-5-嘧啶甲酰胺 | 艾代拉里斯 | Dactolisib (BEZ235) | 槲皮素 | SAR405 | 2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺酰基)-1-哌嗪基]甲基]-4-(4-吗啉基)噻吩并[3,2-D]嘧啶 | 740 Y-P | LY3023414 | 1,3-二咖啡酰奎宁酸