阿法替尼的生物活性_阿法替尼的实验方法

阿法替尼是一种癌症药物，可干扰体内癌细胞的生长和扩散。阿法替尼用于治疗已经扩散到身体其他部位的某种类型的非小细胞肺癌。 只有当您的肿瘤具有您的医生将要测试的特定遗传标记时，阿法替尼才用于此病症。阿法替尼还用于治疗在未经成功治疗的情况下尝试过其他癌症药物后已扩散到身体其他部位的鳞状非小细胞肺癌。

一、阿法替尼的生物活性详解：
1）体外活性
在体外，BIBW2992能够抑制EGFR/HER2，对于野生型EGFR（IC50=0.5 nM） ,L858R突变型EGFR（IC50=0.4nM）, L858R/T790M 双突变型EGFR（IC50=10nM），及HER2（ IC50=14 nM）。在细胞中，BIBW2992能够有效抑制所有实验类型细胞的EGFR/HER磷酸化，比如人类扁平上皮癌A431细胞系表达的野生型EGFR, 鼠类NIH-3T3细胞转染的野生型HER2 , 以及乳腺癌BT-474细胞系和胃癌NCI-N87细胞系表达的内源性HER2。

2）体内活性
在动物实验中，口服BIBW2992（20 mg/kg）通过抑制EGFR和AKT的磷酸化，能够抑制肿瘤细胞生长。

二、阿法替尼的实验方法：
1）细胞实验
将1×104个NSCLC细胞转移到96孔板的每个孔中，并在无血清培养基中培养过夜，用于EGFR磷酸化测定。 在第二天加入BIBW2992后，将板在37℃温育1小时。 在室温下使用100ng / mL进行EGF刺激10分钟。 用冰冷的PBS洗涤细胞，每孔用120μLHEPEX缓冲液提取并在室温下振荡1小时。 在所有2×104个细胞中，每孔用于HER2磷酸化测定。 链霉抗生物素蛋白预涂板用在封闭缓冲液和c-erb2 / HER2癌蛋白Ab-5（克隆N24） - 生物素中以1：100稀释的抗EGFR-生物素包被。 然后将细胞提取物转移到涂有抗体的孔中，并在室温下温育1小时。 消光在450nm处测量。

2）动物实验
动物模型：Athymic NMRI-nu/nu femice

3）激酶实验
体外激酶活性测定：人EGFR的野生型酪氨酸激酶结构域以及EGFR L858R / T790M双突变体的野生型酪氨酸激酶结构域与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合，并被提取。 然后在抑制剂BIBW2992存在下测定酶活性，在50％DMSO中连续稀释。 使用无规聚合物pEY（4：1）作为底物，并加入生物素化的pEY（bio-pEY）作为示踪底物。 使用杆状病毒系统克隆HER2的激酶结构域，并且与EGFR激酶类似地提取。 有关EGFR，HER2，SRC，BIRK和VEGFR2激酶活性的检测详情，请参阅补充信息。

综上所述：阿法替尼是一种酪氨酸激酶受体抑制剂，用于治疗选定形式的转移性非小细胞肺癌。它的靶点活性为EGFR (L858R),0.4nM；EGFR (L858R/T790M),10nM；EGFR (wt),0.5nM；HER2,14nM。

参考文献：
1. Li D, et al. Oncogene, 2008, 27(34), 4702-4711.