甲苯磺酸索拉非尼的作用和生物活性
发布时间：2018-10-30 12:40:55 编辑作者：活性达人
图片：甲苯磺酸索拉非尼结构式
甲苯磺酸索拉非尼是索拉非尼的甲苯磺酸盐，索拉非尼是一种靶向生长信号和血管生成的合成化合物。索拉非尼阻断酶RAF激酶，这是控制细胞分裂和增殖的RAF/MEK/ERK信号通路的关键组分;此外，索拉非尼抑制VEGFR-2/PDGFR-β信号级联反应，从而阻断肿瘤血管生成。
一、甲苯磺酸索拉非尼的生物活性详解：
1）体外活性
索拉非尼能够抑制EGFR，IGFR-1，c-met和HER-2RTKs。此外，索拉非尼有效抑制细胞中VEGFR-2信号。索拉非尼能够剂量依赖性抑制MEK1/2和ERK1/2磷酸化索拉非尼作用于MDA-MB-231乳腺癌细胞系，完全抑制MAPK通路的激活。索拉非尼选择性抑制MAPK，但不抑制PKB通路。索拉非尼在人胰脏(MiaPaCa2)和结肠(HCT116和HT-29)肿瘤细胞中抑制pERK。
甲苯磺酸索拉非尼还抑制BRAFwt（IC50=22nM），BRAFV599E（IC50=38nM），VEGFR-2（IC50=90nM），VEGFR-3（IC50=20nM），PDGFR-β（IC50=57nM），生化分析中c-KIT（IC50=68nM）和Flt3（IC50=58nM）[1]。当用抗人抗HGF抗体共同处理10-0505细胞时，索拉非尼诱导的c-Met，p70S6K和4EBP1磷酸化显着降低，表明用甲苯磺酸索拉非尼治疗导致HGF分泌增加和c-Met活化和mTOR目标[2]。
2）体内活性
甲苯磺酸索拉非尼（10,30,50和100mg/kg，口服）治疗以剂量依赖性方式抑制06-0606和10-0505异种移植物的肿瘤生长（P<0.01）。索拉非尼也显着降低了06-0606和10-0505异种移植物的生长速率。用索拉非尼50mg/kg和100mg/kg治疗的小鼠中06-0606肿瘤的重量分别为对照的约13％和5％。50mg剂量的索拉非尼显着抑制5-1318,26-1004和10-0505行的小鼠肿瘤生长（P<0.01）。对于50mg剂量，T/C比率，其中T和C分别是治疗结束时索拉非尼和载体治疗的肿瘤的中位数重量（mg），分别为06-0606,26-1004,5-1318和10-0505异种移植物分别为0.13,0.10,0.12和0.49[2]。二乙基亚硝胺（DENA）组的存活率为73.3％，索拉非尼组的存活率为83.3％，而正常对照组的存活率为100％。与正常对照组相比，DENA组显示肝脏指数显着增加（1.51倍增加，p<0.05），而与DENA组相比，索拉非尼治疗显示肝脏指数显着降低（p<0.05）。索拉非尼组的肝脏指数显着降低至低于正常对照组的值[3]。
二、甲苯磺酸索拉非尼的活性实验方法：
1）动物实验
小鼠[2]-对于剂量反应实验，给予携带06-0606和10-0505异种移植物的小鼠4次口服索拉非尼（10,30,50和100mg/kg每日），持续12天。每个治疗组由五只小鼠组成。为了研究索拉非尼的抗肿瘤作用，每天口服给予患有肿瘤的小鼠50mg/kg索拉非尼，持续12天。每个处理组由14只动物组成，每个实验重复至少两次。肿瘤植入后第7天开始治疗。到这时，HCC异种移植物达到约100mm3的大小。为了研究雷帕霉素和索拉非尼对10-0505异种移植物生长的影响，给患有肿瘤的小鼠（每组14只）口服200μL载体，或50mg/kg索拉非尼，或1mg/kg雷帕霉素，或指定天数的雷帕霉素加索拉非尼。通过游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，每周至少监测肿瘤生长两次。肿瘤体积计算如下：[长×宽2×π/6]。在研究结束时，用体重杀死小鼠并记录肿瘤重量，收集肿瘤用于分析。
大鼠[3]-在该研究中，使用100至120g雄性白化病大鼠。在适应期后，将大鼠称重并随机分成三组：第1组（正常对照组;n=10）每天给予载体8周。第2组（DENA组;n=15）接受i.p.单剂量200mg/kgDENA。第3组（索拉非尼组;n=12）以10mg/kg的剂量口服给予索拉非尼，持续2周，在DENAi.p.后6周。注射。在实验结束时（8周），将大鼠称重，用乙醚麻醉并杀死，解剖它们的肝脏。将新鲜肝脏用冰冷的盐水洗涤两次，在干净的纸巾上干燥，并称重。肝脏指数计算为肝脏重量（g）/最终体重（g）×100。将肝脏分成五部分：一部分保存在10％福尔马林中用于组织病理学检查，另一部分立即在液氮中冷冻并储存在-80℃。
2）细胞实验
将10-0505,06-0606和26-1004肿瘤精细切碎并用改良的Eagle培养基（MEM）洗涤三次。通过以800×g离心10分钟收获细胞。在存在或不存在5μg/mL抗人肝细胞生长因子（HGF）抗体的情况下，用无血清MEM中的3或6μM索拉非尼处理细胞48小时。收集来自媒介物或索拉非尼处理的（无抗人抗体）的总共2mL条件培养基并使用VIVASPIN20浓缩，并通过蛋白质印迹测定条件培养基中的分泌的HGF[2]。
3）激酶实验
将表达Raf-1（残基305-648）和B-Raf（残基409-765）的重组杆状病毒纯化为融合蛋白。通过PCR产生全长人MEK-1，并纯化为来自大肠杆菌裂解物的融合蛋白。将甲苯磺酸索拉非尼加入到Raf-1（80ng）或B-Raf（80ng）与MEK-1（1μg）在测定缓冲液[20mMTris（pH8.2），100mMNaCl，5mM）的混合物中MgCl2和0.15％β-巯基乙醇]，终浓度为1％DMSO。通过添加25μL的10μMγ[33P]ATP（400Ci/mol）启动Raf激酶测定（终体积50μL），并在32℃下孵育25分钟。
通过过滤将磷酸化的MEK-1收获到磷酸纤维素垫上，并使用1％的磷酸洗去未结合的放射性。在通过微波加热干燥后，使用β-平板计数器来量化过滤器结合的放射性。从Sf9裂解物表达并纯化人VEGFR2（KDR）激酶结构域。VEGFR2的时间分辨荧光能量转移测定在96孔不透明板中以时间分辨荧光能量转移形式进行。最终反应条件如下：1至10μMATP，25nM聚GT-生物素，2nM铕标记的磷酸（p）-Tyr抗体（PY20），10nMAPC，1至7nM细胞质激酶结构域，终浓度1％DMSO，50mMHEPES（pH7.5），10mMMgCl2,0.1mMEDTA，0.015％Brij-35,0.1mg/mLBSA和0.1％β-巯基乙醇。反应体积为100μL并通过添加酶引发。
在反应开始后约1.5至2.0小时，在Perkin-ElmerVictorVMultilabel计数器上以615和665nM读板。信号计算为每个孔的比率：（665nm/615nM）×10,000。对于IC50代，在酶启动前加入甲苯磺酸索拉非尼。用在50％DMSO/50％蒸馏水溶液中1：3连续稀释的甲苯磺酸索拉非尼制备50倍的储备板。在1％DMSO中，最终甲苯磺酸索拉非尼浓度范围为10μM至4.56nM。
综上所述：甲苯磺酸索拉非尼是一种有效的多激酶抑制剂，抑制Raf-1，B-Raf和VEGFR-3的IC50分别为6nM，20nM和22nM。它的靶点活性为ALK,1nM；ROS1,1nM；TrkA,1nM；TrkB,1nM；TrkC,1nM。
参考文献：
[1]. Wilhelm SM, et al. BAY 43-9006 exhibits broad spectrum oral antitumor activity and targets the RAF/MEK/ERK pathway and receptor tyrosine kinases involved in tumor progression and angiogenesis. Cancer Res. 2004 Oct 1;64(19):7099-109.
[2]. Huynh H, et al. Sorafenib and rapamycin induce growth suppression in mouse models of hepatocellular carcinoma. J Cell Mol Med. 2009 Aug;13(8B):2673-83.
[3]. El-Ashmawy NE, et al. Sorafenib effect on liver neoplastic changes in rats: more than a kinase inhibitor. Clin Exp Med. 2016 Apr 16.
[4]. Zhu W, et al. Combination of sorafenib and Valproic acid synergistically induces cell apoptosis and inhibits hepatocellular carcinoma growth via down-regulating Notch3 and pAkt. Am J Cancer Res. 2017 Dec 1;7(12):2503-2514.
一、甲苯磺酸索拉非尼的生物活性详解：
1）体外活性
索拉非尼能够抑制EGFR，IGFR-1，c-met和HER-2RTKs。此外，索拉非尼有效抑制细胞中VEGFR-2信号。索拉非尼能够剂量依赖性抑制MEK1/2和ERK1/2磷酸化索拉非尼作用于MDA-MB-231乳腺癌细胞系，完全抑制MAPK通路的激活。索拉非尼选择性抑制MAPK，但不抑制PKB通路。索拉非尼在人胰脏(MiaPaCa2)和结肠(HCT116和HT-29)肿瘤细胞中抑制pERK。
甲苯磺酸索拉非尼还抑制BRAFwt（IC50=22nM），BRAFV599E（IC50=38nM），VEGFR-2（IC50=90nM），VEGFR-3（IC50=20nM），PDGFR-β（IC50=57nM），生化分析中c-KIT（IC50=68nM）和Flt3（IC50=58nM）[1]。当用抗人抗HGF抗体共同处理10-0505细胞时，索拉非尼诱导的c-Met，p70S6K和4EBP1磷酸化显着降低，表明用甲苯磺酸索拉非尼治疗导致HGF分泌增加和c-Met活化和mTOR目标[2]。
2）体内活性
甲苯磺酸索拉非尼（10,30,50和100mg/kg，口服）治疗以剂量依赖性方式抑制06-0606和10-0505异种移植物的肿瘤生长（P<0.01）。索拉非尼也显着降低了06-0606和10-0505异种移植物的生长速率。用索拉非尼50mg/kg和100mg/kg治疗的小鼠中06-0606肿瘤的重量分别为对照的约13％和5％。50mg剂量的索拉非尼显着抑制5-1318,26-1004和10-0505行的小鼠肿瘤生长（P<0.01）。对于50mg剂量，T/C比率，其中T和C分别是治疗结束时索拉非尼和载体治疗的肿瘤的中位数重量（mg），分别为06-0606,26-1004,5-1318和10-0505异种移植物分别为0.13,0.10,0.12和0.49[2]。二乙基亚硝胺（DENA）组的存活率为73.3％，索拉非尼组的存活率为83.3％，而正常对照组的存活率为100％。与正常对照组相比，DENA组显示肝脏指数显着增加（1.51倍增加，p<0.05），而与DENA组相比，索拉非尼治疗显示肝脏指数显着降低（p<0.05）。索拉非尼组的肝脏指数显着降低至低于正常对照组的值[3]。
二、甲苯磺酸索拉非尼的活性实验方法：
1）动物实验
小鼠[2]-对于剂量反应实验，给予携带06-0606和10-0505异种移植物的小鼠4次口服索拉非尼（10,30,50和100mg/kg每日），持续12天。每个治疗组由五只小鼠组成。为了研究索拉非尼的抗肿瘤作用，每天口服给予患有肿瘤的小鼠50mg/kg索拉非尼，持续12天。每个处理组由14只动物组成，每个实验重复至少两次。肿瘤植入后第7天开始治疗。到这时，HCC异种移植物达到约100mm3的大小。为了研究雷帕霉素和索拉非尼对10-0505异种移植物生长的影响，给患有肿瘤的小鼠（每组14只）口服200μL载体，或50mg/kg索拉非尼，或1mg/kg雷帕霉素，或指定天数的雷帕霉素加索拉非尼。通过游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，每周至少监测肿瘤生长两次。肿瘤体积计算如下：[长×宽2×π/6]。在研究结束时，用体重杀死小鼠并记录肿瘤重量，收集肿瘤用于分析。
大鼠[3]-在该研究中，使用100至120g雄性白化病大鼠。在适应期后，将大鼠称重并随机分成三组：第1组（正常对照组;n=10）每天给予载体8周。第2组（DENA组;n=15）接受i.p.单剂量200mg/kgDENA。第3组（索拉非尼组;n=12）以10mg/kg的剂量口服给予索拉非尼，持续2周，在DENAi.p.后6周。注射。在实验结束时（8周），将大鼠称重，用乙醚麻醉并杀死，解剖它们的肝脏。将新鲜肝脏用冰冷的盐水洗涤两次，在干净的纸巾上干燥，并称重。肝脏指数计算为肝脏重量（g）/最终体重（g）×100。将肝脏分成五部分：一部分保存在10％福尔马林中用于组织病理学检查，另一部分立即在液氮中冷冻并储存在-80℃。
2）细胞实验
将10-0505,06-0606和26-1004肿瘤精细切碎并用改良的Eagle培养基（MEM）洗涤三次。通过以800×g离心10分钟收获细胞。在存在或不存在5μg/mL抗人肝细胞生长因子（HGF）抗体的情况下，用无血清MEM中的3或6μM索拉非尼处理细胞48小时。收集来自媒介物或索拉非尼处理的（无抗人抗体）的总共2mL条件培养基并使用VIVASPIN20浓缩，并通过蛋白质印迹测定条件培养基中的分泌的HGF[2]。
3）激酶实验
将表达Raf-1（残基305-648）和B-Raf（残基409-765）的重组杆状病毒纯化为融合蛋白。通过PCR产生全长人MEK-1，并纯化为来自大肠杆菌裂解物的融合蛋白。将甲苯磺酸索拉非尼加入到Raf-1（80ng）或B-Raf（80ng）与MEK-1（1μg）在测定缓冲液[20mMTris（pH8.2），100mMNaCl，5mM）的混合物中MgCl2和0.15％β-巯基乙醇]，终浓度为1％DMSO。通过添加25μL的10μMγ[33P]ATP（400Ci/mol）启动Raf激酶测定（终体积50μL），并在32℃下孵育25分钟。
通过过滤将磷酸化的MEK-1收获到磷酸纤维素垫上，并使用1％的磷酸洗去未结合的放射性。在通过微波加热干燥后，使用β-平板计数器来量化过滤器结合的放射性。从Sf9裂解物表达并纯化人VEGFR2（KDR）激酶结构域。VEGFR2的时间分辨荧光能量转移测定在96孔不透明板中以时间分辨荧光能量转移形式进行。最终反应条件如下：1至10μMATP，25nM聚GT-生物素，2nM铕标记的磷酸（p）-Tyr抗体（PY20），10nMAPC，1至7nM细胞质激酶结构域，终浓度1％DMSO，50mMHEPES（pH7.5），10mMMgCl2,0.1mMEDTA，0.015％Brij-35,0.1mg/mLBSA和0.1％β-巯基乙醇。反应体积为100μL并通过添加酶引发。
在反应开始后约1.5至2.0小时，在Perkin-ElmerVictorVMultilabel计数器上以615和665nM读板。信号计算为每个孔的比率：（665nm/615nM）×10,000。对于IC50代，在酶启动前加入甲苯磺酸索拉非尼。用在50％DMSO/50％蒸馏水溶液中1：3连续稀释的甲苯磺酸索拉非尼制备50倍的储备板。在1％DMSO中，最终甲苯磺酸索拉非尼浓度范围为10μM至4.56nM。
综上所述：甲苯磺酸索拉非尼是一种有效的多激酶抑制剂，抑制Raf-1，B-Raf和VEGFR-3的IC50分别为6nM，20nM和22nM。它的靶点活性为ALK,1nM；ROS1,1nM；TrkA,1nM；TrkB,1nM；TrkC,1nM。
参考文献：
[1]. Wilhelm SM, et al. BAY 43-9006 exhibits broad spectrum oral antitumor activity and targets the RAF/MEK/ERK pathway and receptor tyrosine kinases involved in tumor progression and angiogenesis. Cancer Res. 2004 Oct 1;64(19):7099-109.
[2]. Huynh H, et al. Sorafenib and rapamycin induce growth suppression in mouse models of hepatocellular carcinoma. J Cell Mol Med. 2009 Aug;13(8B):2673-83.
[3]. El-Ashmawy NE, et al. Sorafenib effect on liver neoplastic changes in rats: more than a kinase inhibitor. Clin Exp Med. 2016 Apr 16.
[4]. Zhu W, et al. Combination of sorafenib and Valproic acid synergistically induces cell apoptosis and inhibits hepatocellular carcinoma growth via down-regulating Notch3 and pAkt. Am J Cancer Res. 2017 Dec 1;7(12):2503-2514.
相关化合物：甲苯磺酸索拉非尼
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