盐酸帕唑帕尼_作用_生物活性
发布时间：2018-10-31 20:16:02 编辑作者：活性达人
图片：盐酸帕唑帕尼结构式
盐酸帕唑帕尼（GW786034盐酸盐）是VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，PDGFR，FGFR，c-Kit和c-Fms的新型多靶点抑制剂，IC50为10nM，30nM，47nM，84nM，74nM，140分别在无细胞试验中nM和146nM。
一、盐酸帕唑帕尼的生物活性详解：
1）体外活性
帕唑帕尼显示出对所有人VEGFR受体的良好效力，VEGFR-1，-2和-3的IC50分别为10,30和47nM。对于密切相关的酪氨酸受体激酶PDGFRβ，c-Kit，FGF-R1和c-fms也观察到显着的活性，IC50分别为84,74,140和146nM。在细胞试验中，除抑制VEGF诱导的HUVEC增殖外，帕唑帕尼还有效抑制VEGF诱导的HUVEC细胞中VEGFR-2的磷酸化，IC50为~8nM。帕唑帕尼在大鼠，狗和猴中具有良好的药代动力学，具有低清除率（1.4-1.7mL/min/kg）和良好的口服生物利用度（72,47,65％），分别以10,1和5mg/kg给药。除2C9（7.9μM）外，细胞色素P450谱对针对所测试的同工酶的抑制>10μM也得到改善[1]。
2）体内活性
用100mg/kg帕唑帕尼每天两次治疗小鼠五天导致血管化程度的显着抑制。在标准的三周疗程后，使用HT29（结肠癌），A375P（黑素瘤）和HN5（头颈癌）肿瘤在携带已建立的人异种移植物（200-250mm3）的小鼠中检查帕唑帕尼的抗血管生成活性。与A375P模型相比，HN5和HT29异种移植物在所有剂量下反应更好，A375P模型历来对VEGFR-2抑制剂具有更强的抗性。
作为观察到的异种移植物生长抑制作用通过抗血管生成而非抗肿瘤机制起作用的支持，对于在含血清培养基中生长的这些人肿瘤系（HT29，HN5，A375P），帕唑帕尼在10μM以下未观察到抗增殖活性。没有观察到对小鼠体重的显着影响，并且在整个研究期间动物显得健康和活跃[1]。帕唑帕尼滴眼剂组中粘附的白细胞数量少于未治疗的糖尿病动物，且多于健康动物。在健康动物中粘附到视网膜脉管系统的平均白细胞是37.2±7.8，而糖尿病动物的平均值是102±15.6，比健康动物高约3倍。用0.5％w/v帕唑帕尼悬浮液处理的动物显示其视网膜脉管系统中粘附有69.5±9.5个白细胞，发现其明显低于糖尿病动物[2]。
二、盐酸帕唑帕尼的活性实验方法：
1）动物实验
小鼠[1]-通过在8-12周龄裸鼠中注射肿瘤细胞悬浮液来启动肿瘤。当肿瘤达到100-200mm3的体积时，将小鼠随机分成8组。帕唑帕尼每天给药一次或两次，剂量为10,30或100mg/kg。在研究完成时通过吸入CO2使动物安乐死。使用以下等式每周两次测量肿瘤体积：肿瘤体积（mm3）=（长度×宽度2）/2。结果通常报告为％抑制=1-（药物处理群体的平均生长/载体处理的对照群体的平均生长）。
大鼠[2]-在任何实验程序之前，使体重为200至250g的雄性Brown-Norway（BN;着色）大鼠适应环境至少两天。隔夜禁食12-16小时后，给予腹膜内注射30mg/mL链脲佐菌素在10mM柠檬酸盐缓冲液（pH4.5）中的溶液（60mg/kg体重）以诱导糖尿病。注射链脲佐菌素3-4小时后，对动物进行常规饮食，并在注射链脲佐菌素后24小时，通过尾静脉收集血液样品（5-10μL）。用葡萄糖监测仪测定动物的血糖水平。血糖水平大于250mg/dL的动物被认为是糖尿病。动物分为三组。第1组：健康（n=12），第2组：糖尿病（n=12）和第3组：糖尿病+治疗（n=12）。在糖尿病诱导后立即开始治疗。用0.5％w/v帕唑帕尼悬浮液（每只眼睛中10μL体积）每天两次给药两次眼睛30天，并且在第30天最后一次给药后第31天，第16-17小时处死所有组中的动物。
2）细胞实验
在用VEGF刺激的HUVEC中评估VEGFR2的磷酸化。将HUVEC以1.0-1.5×106个细胞/平板接种在CloneticsEGM-MV培养基中的I型胶原包被的10cm平板中。24小时后，通过用含有0.1％BSA，500μg/mL氢化可的松的CloneticsEBM培养基替换生长培养基，使融合细胞血清饥饿过夜。用各种浓度的帕唑帕尼处理细胞1小时，然后加入10ng/mLVEGF或载体10分钟。将细胞溶解在裂解缓冲液中。使用抗flk-1抗体对VEGFR2进行免疫沉淀，并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，然后进行Western印迹并用抗flk-1或抗磷酸酪氨酸（抗-P-tyr-生物素）抗体检测。通过光密度测定法量化VEGFR2磷酸化水平，并将其归一化至总VEGFR2水平。
3）激酶实验
VEGFR酶测定通过添加10μL活化的VEGFR2激酶溶液[终浓度，1nM酶在0.1M4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH7.5，含0.1mg/mL）启动牛血清白蛋白（BSA），300μM二硫苏糖醇（DTT）]至10μL底物溶液[终浓度，360nM肽，（生物素-氨基己基-EEEEYFELVAKKKK-NH2），75μMATP，10μMMgCl2]和1μL在DMSO中滴定化合物（帕唑帕尼）。将板在室温下孵育60分钟，然后通过加入20μL100mM乙二胺四乙酸（EDTA）淬灭反应。猝灭后，加入20μLHTRF试剂（终浓度，15nM链霉抗生物素蛋白连接的别藻蓝蛋白，1nM铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体，稀释于0.1mg/mLBSA，0.1MHEPES，pH7.5），并将板孵育至少10分钟用平板读数器[1]测量665nM的荧光。
综上所述：盐酸帕唑帕尼帕唑帕尼Hydrochloride（GW-786034）盐酸盐是多靶点抑制剂，对VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，PDGFR，FGFR，c-Kit和c-Fms的IC50分别为10nM，30nM，47nM，84nM，74nM，140nM和146nM。它的靶点活性为FGFR,74nM；PDGFR,84nM；VEGFR1,10nM；VEGFR2,30nM；VEGFR3,47nM。
参考文献：
[1]. Harris PA, et al. Discovery of 5-[[4-[(2,3-dimethyl-2H-indazol-6-yl)methylamino]-2-pyrimidinyl]amino]-2-methyl-benzenesulfonamide (Pazopanib), a novel and potent vascular endothelial growth factor receptor inhibitor. J Med Chem. 2008, 51(15), 4632-4640.
[2]. Thakur A, et al. Pazopanib, a multitargeted tyrosine kinase inhibitor, reduces diabetic retinal vascular leukostasis and leakage. Microvasc Res. 2011 Nov;82(3):346-50.
一、盐酸帕唑帕尼的生物活性详解：
1）体外活性
帕唑帕尼显示出对所有人VEGFR受体的良好效力，VEGFR-1，-2和-3的IC50分别为10,30和47nM。对于密切相关的酪氨酸受体激酶PDGFRβ，c-Kit，FGF-R1和c-fms也观察到显着的活性，IC50分别为84,74,140和146nM。在细胞试验中，除抑制VEGF诱导的HUVEC增殖外，帕唑帕尼还有效抑制VEGF诱导的HUVEC细胞中VEGFR-2的磷酸化，IC50为~8nM。帕唑帕尼在大鼠，狗和猴中具有良好的药代动力学，具有低清除率（1.4-1.7mL/min/kg）和良好的口服生物利用度（72,47,65％），分别以10,1和5mg/kg给药。除2C9（7.9μM）外，细胞色素P450谱对针对所测试的同工酶的抑制>10μM也得到改善[1]。
2）体内活性
用100mg/kg帕唑帕尼每天两次治疗小鼠五天导致血管化程度的显着抑制。在标准的三周疗程后，使用HT29（结肠癌），A375P（黑素瘤）和HN5（头颈癌）肿瘤在携带已建立的人异种移植物（200-250mm3）的小鼠中检查帕唑帕尼的抗血管生成活性。与A375P模型相比，HN5和HT29异种移植物在所有剂量下反应更好，A375P模型历来对VEGFR-2抑制剂具有更强的抗性。
作为观察到的异种移植物生长抑制作用通过抗血管生成而非抗肿瘤机制起作用的支持，对于在含血清培养基中生长的这些人肿瘤系（HT29，HN5，A375P），帕唑帕尼在10μM以下未观察到抗增殖活性。没有观察到对小鼠体重的显着影响，并且在整个研究期间动物显得健康和活跃[1]。帕唑帕尼滴眼剂组中粘附的白细胞数量少于未治疗的糖尿病动物，且多于健康动物。在健康动物中粘附到视网膜脉管系统的平均白细胞是37.2±7.8，而糖尿病动物的平均值是102±15.6，比健康动物高约3倍。用0.5％w/v帕唑帕尼悬浮液处理的动物显示其视网膜脉管系统中粘附有69.5±9.5个白细胞，发现其明显低于糖尿病动物[2]。
二、盐酸帕唑帕尼的活性实验方法：
1）动物实验
小鼠[1]-通过在8-12周龄裸鼠中注射肿瘤细胞悬浮液来启动肿瘤。当肿瘤达到100-200mm3的体积时，将小鼠随机分成8组。帕唑帕尼每天给药一次或两次，剂量为10,30或100mg/kg。在研究完成时通过吸入CO2使动物安乐死。使用以下等式每周两次测量肿瘤体积：肿瘤体积（mm3）=（长度×宽度2）/2。结果通常报告为％抑制=1-（药物处理群体的平均生长/载体处理的对照群体的平均生长）。
大鼠[2]-在任何实验程序之前，使体重为200至250g的雄性Brown-Norway（BN;着色）大鼠适应环境至少两天。隔夜禁食12-16小时后，给予腹膜内注射30mg/mL链脲佐菌素在10mM柠檬酸盐缓冲液（pH4.5）中的溶液（60mg/kg体重）以诱导糖尿病。注射链脲佐菌素3-4小时后，对动物进行常规饮食，并在注射链脲佐菌素后24小时，通过尾静脉收集血液样品（5-10μL）。用葡萄糖监测仪测定动物的血糖水平。血糖水平大于250mg/dL的动物被认为是糖尿病。动物分为三组。第1组：健康（n=12），第2组：糖尿病（n=12）和第3组：糖尿病+治疗（n=12）。在糖尿病诱导后立即开始治疗。用0.5％w/v帕唑帕尼悬浮液（每只眼睛中10μL体积）每天两次给药两次眼睛30天，并且在第30天最后一次给药后第31天，第16-17小时处死所有组中的动物。
2）细胞实验
在用VEGF刺激的HUVEC中评估VEGFR2的磷酸化。将HUVEC以1.0-1.5×106个细胞/平板接种在CloneticsEGM-MV培养基中的I型胶原包被的10cm平板中。24小时后，通过用含有0.1％BSA，500μg/mL氢化可的松的CloneticsEBM培养基替换生长培养基，使融合细胞血清饥饿过夜。用各种浓度的帕唑帕尼处理细胞1小时，然后加入10ng/mLVEGF或载体10分钟。将细胞溶解在裂解缓冲液中。使用抗flk-1抗体对VEGFR2进行免疫沉淀，并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，然后进行Western印迹并用抗flk-1或抗磷酸酪氨酸（抗-P-tyr-生物素）抗体检测。通过光密度测定法量化VEGFR2磷酸化水平，并将其归一化至总VEGFR2水平。
3）激酶实验
VEGFR酶测定通过添加10μL活化的VEGFR2激酶溶液[终浓度，1nM酶在0.1M4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH7.5，含0.1mg/mL）启动牛血清白蛋白（BSA），300μM二硫苏糖醇（DTT）]至10μL底物溶液[终浓度，360nM肽，（生物素-氨基己基-EEEEYFELVAKKKK-NH2），75μMATP，10μMMgCl2]和1μL在DMSO中滴定化合物（帕唑帕尼）。将板在室温下孵育60分钟，然后通过加入20μL100mM乙二胺四乙酸（EDTA）淬灭反应。猝灭后，加入20μLHTRF试剂（终浓度，15nM链霉抗生物素蛋白连接的别藻蓝蛋白，1nM铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体，稀释于0.1mg/mLBSA，0.1MHEPES，pH7.5），并将板孵育至少10分钟用平板读数器[1]测量665nM的荧光。
综上所述：盐酸帕唑帕尼帕唑帕尼Hydrochloride（GW-786034）盐酸盐是多靶点抑制剂，对VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，PDGFR，FGFR，c-Kit和c-Fms的IC50分别为10nM，30nM，47nM，84nM，74nM，140nM和146nM。它的靶点活性为FGFR,74nM；PDGFR,84nM；VEGFR1,10nM；VEGFR2,30nM；VEGFR3,47nM。
参考文献：
[1]. Harris PA, et al. Discovery of 5-[[4-[(2,3-dimethyl-2H-indazol-6-yl)methylamino]-2-pyrimidinyl]amino]-2-methyl-benzenesulfonamide (Pazopanib), a novel and potent vascular endothelial growth factor receptor inhibitor. J Med Chem. 2008, 51(15), 4632-4640.
[2]. Thakur A, et al. Pazopanib, a multitargeted tyrosine kinase inhibitor, reduces diabetic retinal vascular leukostasis and leakage. Microvasc Res. 2011 Nov;82(3):346-50.
相关化合物：盐酸帕唑帕尼
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