CE3F4

CE3F4 是一种选择性的 Epac1 拮抗剂,对 Epac1 和 Epac2(B) 的 IC50 值分别为 10.7 μM 和 66 μM。

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IC50: 10.7 μM (Epac1), 66 μM (Epac2(B))[1]

CE3F4是Epac1的选择性拮抗剂,Epac1和Epac2(B)的IC50分别为10.7μM和66μM。 CE3F4在Epac1上比(S)-立体异构体((S)-CE3F4,IC50,56μM)更具活性,但活性低于(R)-CE3F4(IC50,5.8μM)。 CE3F4(50μM)对Epac1的GEF活性的抑制活性高于Epac2(AB)或Epac2(B)[1]。 CE3F4降低了由007诱导的Epac1的交换活性,IC50为23±3μM。 CE3F4(40μM)特异性抑制Epac1鸟嘌呤核苷酸交换活性而不干扰Rap1活性或Epac1-Rap1相互作用。 CE3F4对PKA活性没有影响。 CE3F4(20μM)抑制活体培养的HEK293细胞中Epac诱导的Rap1活化[2]。 CE3F4(20μM)显着抑制INS-1细胞中葡萄糖刺激的ERK活化晚期[3]。

为了确定Epac1交换活性，将200nM预装有bGDP的纯化GST-Rap1A在22℃下在交换缓冲液（50mM Tris-HCl（pH 7.5），50mM NaCl，5mM MgCl 2,5mM 1,4-中孵育。在100nM纯化的GST-Epac1或GST-Epac1-Cat存在下，二硫赤藓糖醇，5％甘油，0.01％Nonidet P-40）; 20μM未标记的GDP;和确定的cAMP，环核苷酸类似物和测试化合物（CE3F4）的浓度。实验在黑色384孔板中进行，终体积为30μL。使用多标记板读数器测量bGDP荧光（激发，480nm和发射，535nm）[2]。

将细胞在96孔黑壁板中于37℃和5％CO 2培养过夜，然后在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次。将细胞在37℃和5％CO 2下在无葡萄糖的改良KRBH中预孵育2小时，所述KRBH补充有0.05％不含脂肪酸的BSA。倾析出预孵育缓冲液，并用KRBH中的18mM葡萄糖刺激细胞。在葡萄糖刺激之前，将细胞与或不与抑制剂（CE3F4）在改良的KRBH中在37℃和5％CO 2下孵育30分钟。通过倾析处理并用4％甲醛固定细胞，在指定的时间点终止反应。在使用药理学抑制剂的实验中，在葡萄糖刺激开始后10分钟终止反应。使用Phospho-ERK1（T202 / Y204）/ ERK2（T185 / Y187）基于细胞的ELISA测量总ERK和pERK。在450nm处测量总ERK1 / ERK2，在360nm处激发，并且使用Synergy 4微量板读数器在540nm处激发在540nm处测量磷酸化ERK1 / ERK2。数据表示为pERK与总ERK的比率，然后归一化并表示为基础折叠或％葡萄糖反应[3]。

[1]. Courilleau D, et al. The (R)-enantiomer of CE3F4 is a preferential inhibitor of human exchange protein directly activated by cyclic AMP isoform 1 (Epac1). Biochem Biophys Res Commun. 2013 Oct 25;440(3):443-8.

[2]. Courilleau D, et al. Identification of a tetrahydroquinoline analog as a pharmacological inhibitor of the cAMP-binding protein Epac. J Biol Chem. 2012 Dec 28;287(53):44192-202.

[3]. Pratt EP, et al. Ca2+ influx through L-type Ca2+ channels and Ca2+-induced Ca2+ release regulate cAMP accumulation and Epac1-dependent ERK 1/2 activation in INS-1 cells. Mol Cell Endocrinol. 2016 Jan 5;419:60-71.

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