| 描述 |
CCT244747 是一种有效的,可口服的,高度选择性的 CHK1 抑制剂,IC50 值为 7.7 nM；CCT244747 可废除 G2 检查点,IC50 值为 29 nM。
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| 相关类别 |
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| 靶点 |
Chk1:7.7 nM (IC50)
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| 体外研究 |
CCT244747很差地抑制CHK2(IC50>10μM)和CDK1(IC50>10μM)。 CCT244747具有针对CHK1,RSK1,RSK2,AMPK,BRSK1,IRAK1和TrkA的有效活性,具有> 80％的抑制。 CCT244747(10μM)对其他离子通道的抑制率<25％,包括hNav1.5,hKv4.3/hKChIP2,hCav1.2,hKv1.5,hKCNQ1/hminK,hHCN4 [1]。 CCT244747抑制FLT3,IC50为600 nM。 CCT244747(0.5μM)克服了人结肠癌细胞系中基因毒性诱导的S和G2细胞周期停滞。 CCT244747抑制细胞CHK1功能,其中IC50为29nM至170nM,用于HT29,SW620,MiaPaCa-2和Calu6细胞系中的细胞G2检查点消除(MIA,有丝分裂诱导测定); GI50介于0.33和3μM之间。 CCT244747(0.3μM)在HT29和SW620结肠癌细胞系中抑制SN38和吉西他滨诱导的CHK1活性,这与细胞周期停滞的消除,DNA损伤和细胞凋亡的诱导相关[2]。 CCT244747(0.5-2.0μM)增加膀胱癌和头颈癌细胞系(T24,RT112和Cal27)对辐射的敏感性[3]。
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| 体内研究 |
CCT244747(100mg/kg po,qd7d)显着降低人肿瘤异种移植物中的肿瘤负荷。 CCT244747(100-300mg/kg,口服)在HT29结肠肿瘤异种移植物中抑制吉西他滨诱导的pS296 CHK1长达24小时[1]。 CCT244747(75mg/kg,口服)与吉西他滨组合在HT29结肠肿瘤异种移植物和Calu6人肺癌异种移植物中具有有效的抗肿瘤作用。 CCT244747(150mg/kg口服)也显示在SW620人结肠肿瘤异种移植物中使用伊立替康的抗肿瘤活性[2]。 CCT244747(100mg/kg,po)在Cal27异种移植物中表现出放射增敏活性[3]。
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| 激酶实验 |
在微流体测定中测量CHK1激酶活性，所述微流体测定监测磷酸化产物与其底物的分离。使用含有CR-8（500nM）的分离缓冲液在EZ Reader II上进行测定。 ECHO®550声学分配器用于直接在384个聚丙烯测定板中产生重复的8 pt稀释曲线。对于每种化合物，使用在100％DMSO中的50μM储备浓度。每孔分配的DMSO总量为250nL，得到最终测定浓度为2.5％DMSO，化合物浓度为0.5-1000nM。向该测定板中，6PL CHK1（2nM终浓度，内部蛋白质制备），2PL肽10（5-FAM-KKKVSRSGLYRSPSMPENLNRPR-COOH，1.5PM终浓度）和2PL ATP（终浓度90PM）全部稀释于激酶缓冲液（HEPES 50mM，NaN 3 0.02％，BSA 0.01％，原钒酸钠0.1mM，DTT 1mM，MgCl 2 2mM，Tween20 0.1％）中。将板密封并离心（1分钟，1000rpm），然后在室温下孵育1小时。加入分离缓冲液（90μL）终止反应。使用12-sipper芯片在EZ Reader II上读取板，仪器设置为-1.5 psi和1750ΔV。自动产生来自底物的产物转化百分比，并相对于空白孔（不含酶和2.5％DMSO）和总孔（含有所有试剂和2.5％DMSO）计算抑制百分比。使用log（抑制剂）与响应的非线性回归拟合以及可变斜率方程[1]，在GraphPad Prism5中计算IC 50值。
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| 细胞实验 |
使用96小时磺酰罗丹明B测定（SRB）评估化合物细胞毒性和CHK1抑制剂增强SN38（拓扑异构酶I抑制剂伊立替康的活性代谢物）和吉西他滨（抗代谢物）细胞毒性的能力。将HT29或SW620细胞以1.6至3.2×103个细胞/孔接种于96孔板中，体积为160μL培养基，并在处理前使其附着36小时。对于细胞毒性测定，将CHK1抑制剂（DMSO中的10mM储备液）在培养基中从250 PM的起始浓度连续稀释，然后将40μL一式四份加入适当的孔中，使最终浓度范围为50-0.1 PM（10个浓度） ）。将基因毒性剂（SN38; DMSO中的10mM储备液）在培养基中从2PM的起始浓度连续稀释，并将40μL一式三份加入到每个孔中，得到200-0.39nM的终浓度（10个浓度）。将细胞在37℃，湿润的5％CO 2环境中孵育96小时（四次倍增），然后固定并用SRB染色。包括适当的对照，结果表示为相对于未处理的对照，抑制细胞生长50％所需的试验化合物浓度（SRB IC50）。增强测定包括将固定的SRB IC50浓度的吉西他滨或SN38以20μL培养基（10x终浓度）的体积加入到每个孔中，一式四份并混合1分钟。将CHK1抑制剂（10mM储备液）从培养基中50μL的起始浓度连续稀释，每孔加入20μL，一式四份，得到5-0.039PM的终浓度范围（8个浓度）。混合1分钟后，在固定和SRB染色之前，将细胞在37℃下在潮湿的气氛中温育96小时（四次倍增）。包括未处理和基因毒性单独处理的对照，结果表示为抑制细胞生长50％所需的CHK1抑制剂浓度（增强IC50）。增强指数（PI）用于衡量CHK1抑制剂增强SN38或吉西他滨细胞毒性的能力，是SRB IC50与增强IC50的比值（PI = SRB IC50 /增强IC50）[1]。
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| 动物实验 |
将雌性BALB / c小鼠（6周龄）保持在受控环境中，随意提供食物和无菌水。在实验时动物体重为20（±2）g。通过将化合物溶于10％DMSO和5％Tween20的85％盐水中来制备给药溶液。化合物分别静脉内和口服给药。在接受单次静脉推注注入侧尾静脉之前将动物加热。口服给药是通过口服强饲法。在选定的时间点（给药后1小时和6小时）通过心脏穿刺在麻醉下将血液收集到肝素化注射器中，转移到微量离心管中，并以4500×g离心2分钟以获得血浆。通过高效液相色谱串联质谱法在三重四极杆仪器上进行定量分析，使用多重反应监测选择的过渡，用作为内标的olomoucine。对测量的基质中浓度为2-1000nM的标准曲线进行定量。质量控制包括在25,250和750 nM的水平。如果需要，将样品稀释在目标基质中[1]。
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| 参考文献 |
[1]. Lainchbury M, et al. Discovery of 3-alkoxyamino-5-(pyridin-2-ylamino)pyrazine-2-carbonitriles as selective, orally bioavailable CHK1 inhibitors. J Med Chem. 2012 Nov 26;55(22):10229-40. [2]. Walton MI, et al. CCT244747 is a novel potent and selective CHK1 inhibitor with oral efficacy alone and in combination with genotoxic anticancer drugs. Clin Cancer Res. 2012 Oct 15;18(20):5650-61. [3]. Patel R, et al. An orally bioavailable Chk1 inhibitor, CCT244747, sensitizes bladder and head and neck cancer cell lines to radiation. Radiother Oncol. 2017 Mar;122(3):470-475.
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