拉帕替尼的生物活性_拉帕替尼实验方法
发布时间：2018-10-18 20:42:45 编辑作者：活性小子
图片：拉帕替尼结构式
拉帕替尼是一种癌症药物，可干扰体内癌细胞的生长和扩散，用于治疗某些类型的激素相关乳腺癌，该乳腺癌在用其他癌症药物治疗后已经进展或扩散。在绝经后妇女中，拉帕替尼与一种名为来曲唑（Femara）的激素药物联合使用。 在其他人中，拉帕替尼与一种名为卡培他滨（希罗达）的癌症药物一起服用。
一、拉帕替尼的生物活性详解：
1）体外活性
拉帕替尼（GW2016）对酶活性抑制的IC50值通过测量肽底物磷酸化的抑制而产生。 除ErbB-4（IC50,367 nM）外，拉帕替尼对EGFR和ErbB-2的选择性> 300倍于其他激酶[1]。 拉坦替尼（GW2016）对BT474，SKBR3，EFM192A，HCC1954，MDAMB453和MDAMB231细胞的IC50值为36±15.1 nM，80±17.3 nM，193±66.5 nM，416.6±180 nM，6.08±0.825μM和7.46±0.102μM ， 分别。 拉帕替尼治疗导致EGFR和过表达ErbB-2的肿瘤细胞系的IC50值≤0.16μM[2]。
培养HN5 细胞群2周（不加拉帕替尼）左右后，再加30 μM 拉帕替尼短暂处理，细胞生长完全被抑制。浓度>3.3 μM时，抑制率达50%；浓度为0.37 μM时，抑制率达20%。另一种细胞A-431（EGFR过量表达）与HN5反应类似。在抑制 EGFR过量表达的细胞生长方面，拉帕替尼与OSI-774相似。除ErbB-4外, 拉帕替尼对EGFR和 ErbB-2的选择性比其他测试激酶高300多倍，如c-Src, MEK和ERK。拉帕替尼抑制EGFR 和ErbB-2受体自磷酸化的作用存在剂量依赖性，对BT474和HN5细胞的IC50分别为0.17和0.08 μM。作用于EGFR-和ErbB-2-过量表达的肿瘤细胞时，拉帕替尼的抑制作用比作用于上述纯化酶的效力低10倍左右。拉帕替尼抑制EGFR- 和ErbB-2过量表达的细胞生长，而EGFR选择性抑制剂OSI-774和 Iressa则会优先抑制 EGFR过量表达的细胞生长。拉帕替尼对肿瘤细胞的作用比正常成纤维细胞效果高约100倍。ErbB-2转染后的乳腺上皮细胞HB4a c5.2对 拉帕替尼的敏感度比未转染的亲本细胞高40倍左右。
2）体内活性
拉帕替尼（GW2016）有效抑制BT474和HN5人肿瘤异种移植物的生长。 两种模型的剂量反应性抑制发生在用含有30和100mg / kg拉帕替尼的荷瘤小鼠治疗，每日两次。 在100mg / kg剂量下观察到肿瘤生长的完全抑制。 在该剂量下，在21天治疗过程中，治疗动物的体重减轻<10％。 拉帕替尼治疗以剂量敏感的方式以30和100 mg / kg口服，每日两次抑制HN5和BT474细胞的肿瘤异种移植物生长，在较高剂量下完全抑制肿瘤生长[1]。 拉帕替尼（100 mg / kg /天，口服强饲法）在大鼠心脏组织中诱导严重的氧化损伤[3]。
二、拉帕替尼的生物活性实验方法：
1）细胞实验
将细胞以下列密度接种于培养基中的96孔板中：HFF和HN5,1000细胞/孔和BT474,5000细胞/孔。 24小时后，将细胞暴露于载体（0.3％DMSO）或拉帕替尼（1nM，10nM，100nM，1μM，10μM和100μM）。 72小时后从细胞中除去拉帕替尼，并用含有10％FBS和50μg/ mL庆大霉素（HFF和HN5）的DMEM或含有10％FBS和50μg/ mL庆大霉素（BT474）的RPMI替换。 亚甲蓝染色在总时间为16天的时间点进行[1]。
2）动物实验
小鼠-CD-1裸雌性小鼠用于HN5人肿瘤异种移植物，其通过在PBS：Matrigel（1：1）中注射细胞悬浮液而起始。 C.B-17SCID雌性小鼠用于BT474人肿瘤异种移植物，其通过从已建立的肿瘤植入肿瘤片段（20-100mg）而起始。通过皮下注射肿瘤细胞和片段。右侧注射。 s.c.用卡尺测量肿瘤，每周称重两次小鼠。使用以下公式从肿瘤体积估计肿瘤重量：长度×宽度2/2 =肿瘤体积（mm 3）。当肿瘤可触及，直径3-5毫米时开始治疗。拉帕替尼（30和100mg / kg）口服给药。在磺基 - 丁基醚-β-环糊精10％水溶液（CD10）的载体中每天两次，持续21天。
大鼠-将Wistar大鼠（12周龄白化雄性）随机分为三组：对照组（C组，n = 8组），曲妥珠单抗组（T，n = 8）和拉帕替尼组（L，n = 8）。对照动物未经治疗，但T组和拉帕替尼组中的其他动物与化疗药物一起给药。曲妥珠单抗在研究的第一天通过腹膜内注射以10mg / kg /天的剂量递送一次。拉帕替尼每天以100mg / kg /天的剂量通过口服强饲法连续给药7天。所选剂量与诊所使用的剂量相当。在第8天，通过单次腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪（分别为50和5mg / kg）诱导麻醉。收集血液样品并取出心脏用于生化分析。
3）激酶实验
从杆状病毒表达系统中纯化EGFR，ErbB-2和ErbB4的细胞内激酶结构域。 EGFR，ErbB-2和ErbB-4反应在96孔聚苯乙烯圆底板中进行，最终体积为45μL。反应混合物含有50mM 4-吗啉丙磺酸（pH7.5），2mMMnCl2,10μMATP，1μCi[γ-33P] ATP /反应，50μM肽A [生物素 - （氨基己酸）-EEEEYFELVAKKK-CONH2 ]，1mM二硫苏糖醇和1μLDMSO，其含有拉帕替尼的连续稀释液，起始浓度为10μM。通过添加指定的纯化的1型受体细胞内结构域来引发反应。酶的加入量为1pmol /反应（20nM）。通过在水中加入45μL的0.5％磷酸，在23℃下10分钟后终止反应。将终止的反应混合物（75μL）转移至磷酸纤维素滤板。将板过滤并用200μL的0.5％磷酸洗涤三次。向每个孔中加入闪烁混合物（50μL），并通过在Packard Topcount中计数来定量测定[1]。
综上所述：拉帕替尼是有效的 EGFR 和 ErbB2 抑制剂，IC50 分别为 10.2 和 9.8 nM。它的靶点活性为C-Raf-1,>10μM；c-Src,3.5μM；EGFR,10.8nM；HER2/ErbB2,367nM。
参考文献：
[1]. Rusnak DW, et al. The effects of the novel, reversible epidermal growth factor receptor/ErbB-2 tyrosine kinase inhibitor, GW2016, on the growth of human normal and tumor-derived cell lines in vitro and in vivo. Mol Cancer Ther. 2001 Dec;1(2):85-94
[2]. O'Neill F, et al. Gene expression changes as markers of early lapatinib response in a panel of breast cancer cell lines. Mol Cancer. 2012 Jun 18;11(1):41.
[3]. Eryilmaz U, et al. S100A1 as a Potential Diagnostic Biomarker for Assessing Cardiotoxicity and Implications for the Chemotherapy of Certain Cancers. PLoS One. 2015 Dec 18;10(12):e0145418.
[4]. Ni J, et al. Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases. Nat Med. 2016 Jul;22(7):723-6.
[5]. Oncogene. 2016 Jun 9;35(23):2961-70. doi: 10.1038/onc.2015.377. Epub 2015 Dec 7.
一、拉帕替尼的生物活性详解：
1）体外活性
拉帕替尼（GW2016）对酶活性抑制的IC50值通过测量肽底物磷酸化的抑制而产生。 除ErbB-4（IC50,367 nM）外，拉帕替尼对EGFR和ErbB-2的选择性> 300倍于其他激酶[1]。 拉坦替尼（GW2016）对BT474，SKBR3，EFM192A，HCC1954，MDAMB453和MDAMB231细胞的IC50值为36±15.1 nM，80±17.3 nM，193±66.5 nM，416.6±180 nM，6.08±0.825μM和7.46±0.102μM ， 分别。 拉帕替尼治疗导致EGFR和过表达ErbB-2的肿瘤细胞系的IC50值≤0.16μM[2]。
培养HN5 细胞群2周（不加拉帕替尼）左右后，再加30 μM 拉帕替尼短暂处理，细胞生长完全被抑制。浓度>3.3 μM时，抑制率达50%；浓度为0.37 μM时，抑制率达20%。另一种细胞A-431（EGFR过量表达）与HN5反应类似。在抑制 EGFR过量表达的细胞生长方面，拉帕替尼与OSI-774相似。除ErbB-4外, 拉帕替尼对EGFR和 ErbB-2的选择性比其他测试激酶高300多倍，如c-Src, MEK和ERK。拉帕替尼抑制EGFR 和ErbB-2受体自磷酸化的作用存在剂量依赖性，对BT474和HN5细胞的IC50分别为0.17和0.08 μM。作用于EGFR-和ErbB-2-过量表达的肿瘤细胞时，拉帕替尼的抑制作用比作用于上述纯化酶的效力低10倍左右。拉帕替尼抑制EGFR- 和ErbB-2过量表达的细胞生长，而EGFR选择性抑制剂OSI-774和 Iressa则会优先抑制 EGFR过量表达的细胞生长。拉帕替尼对肿瘤细胞的作用比正常成纤维细胞效果高约100倍。ErbB-2转染后的乳腺上皮细胞HB4a c5.2对 拉帕替尼的敏感度比未转染的亲本细胞高40倍左右。
2）体内活性
拉帕替尼（GW2016）有效抑制BT474和HN5人肿瘤异种移植物的生长。 两种模型的剂量反应性抑制发生在用含有30和100mg / kg拉帕替尼的荷瘤小鼠治疗，每日两次。 在100mg / kg剂量下观察到肿瘤生长的完全抑制。 在该剂量下，在21天治疗过程中，治疗动物的体重减轻<10％。 拉帕替尼治疗以剂量敏感的方式以30和100 mg / kg口服，每日两次抑制HN5和BT474细胞的肿瘤异种移植物生长，在较高剂量下完全抑制肿瘤生长[1]。 拉帕替尼（100 mg / kg /天，口服强饲法）在大鼠心脏组织中诱导严重的氧化损伤[3]。
二、拉帕替尼的生物活性实验方法：
1）细胞实验
将细胞以下列密度接种于培养基中的96孔板中：HFF和HN5,1000细胞/孔和BT474,5000细胞/孔。 24小时后，将细胞暴露于载体（0.3％DMSO）或拉帕替尼（1nM，10nM，100nM，1μM，10μM和100μM）。 72小时后从细胞中除去拉帕替尼，并用含有10％FBS和50μg/ mL庆大霉素（HFF和HN5）的DMEM或含有10％FBS和50μg/ mL庆大霉素（BT474）的RPMI替换。 亚甲蓝染色在总时间为16天的时间点进行[1]。
2）动物实验
小鼠-CD-1裸雌性小鼠用于HN5人肿瘤异种移植物，其通过在PBS：Matrigel（1：1）中注射细胞悬浮液而起始。 C.B-17SCID雌性小鼠用于BT474人肿瘤异种移植物，其通过从已建立的肿瘤植入肿瘤片段（20-100mg）而起始。通过皮下注射肿瘤细胞和片段。右侧注射。 s.c.用卡尺测量肿瘤，每周称重两次小鼠。使用以下公式从肿瘤体积估计肿瘤重量：长度×宽度2/2 =肿瘤体积（mm 3）。当肿瘤可触及，直径3-5毫米时开始治疗。拉帕替尼（30和100mg / kg）口服给药。在磺基 - 丁基醚-β-环糊精10％水溶液（CD10）的载体中每天两次，持续21天。
大鼠-将Wistar大鼠（12周龄白化雄性）随机分为三组：对照组（C组，n = 8组），曲妥珠单抗组（T，n = 8）和拉帕替尼组（L，n = 8）。对照动物未经治疗，但T组和拉帕替尼组中的其他动物与化疗药物一起给药。曲妥珠单抗在研究的第一天通过腹膜内注射以10mg / kg /天的剂量递送一次。拉帕替尼每天以100mg / kg /天的剂量通过口服强饲法连续给药7天。所选剂量与诊所使用的剂量相当。在第8天，通过单次腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪（分别为50和5mg / kg）诱导麻醉。收集血液样品并取出心脏用于生化分析。
3）激酶实验
从杆状病毒表达系统中纯化EGFR，ErbB-2和ErbB4的细胞内激酶结构域。 EGFR，ErbB-2和ErbB-4反应在96孔聚苯乙烯圆底板中进行，最终体积为45μL。反应混合物含有50mM 4-吗啉丙磺酸（pH7.5），2mMMnCl2,10μMATP，1μCi[γ-33P] ATP /反应，50μM肽A [生物素 - （氨基己酸）-EEEEYFELVAKKK-CONH2 ]，1mM二硫苏糖醇和1μLDMSO，其含有拉帕替尼的连续稀释液，起始浓度为10μM。通过添加指定的纯化的1型受体细胞内结构域来引发反应。酶的加入量为1pmol /反应（20nM）。通过在水中加入45μL的0.5％磷酸，在23℃下10分钟后终止反应。将终止的反应混合物（75μL）转移至磷酸纤维素滤板。将板过滤并用200μL的0.5％磷酸洗涤三次。向每个孔中加入闪烁混合物（50μL），并通过在Packard Topcount中计数来定量测定[1]。
综上所述：拉帕替尼是有效的 EGFR 和 ErbB2 抑制剂，IC50 分别为 10.2 和 9.8 nM。它的靶点活性为C-Raf-1,>10μM；c-Src,3.5μM；EGFR,10.8nM；HER2/ErbB2,367nM。
参考文献：
[1]. Rusnak DW, et al. The effects of the novel, reversible epidermal growth factor receptor/ErbB-2 tyrosine kinase inhibitor, GW2016, on the growth of human normal and tumor-derived cell lines in vitro and in vivo. Mol Cancer Ther. 2001 Dec;1(2):85-94
[2]. O'Neill F, et al. Gene expression changes as markers of early lapatinib response in a panel of breast cancer cell lines. Mol Cancer. 2012 Jun 18;11(1):41.
[3]. Eryilmaz U, et al. S100A1 as a Potential Diagnostic Biomarker for Assessing Cardiotoxicity and Implications for the Chemotherapy of Certain Cancers. PLoS One. 2015 Dec 18;10(12):e0145418.
[4]. Ni J, et al. Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases. Nat Med. 2016 Jul;22(7):723-6.
[5]. Oncogene. 2016 Jun 9;35(23):2961-70. doi: 10.1038/onc.2015.377. Epub 2015 Dec 7.
相关化合物：拉帕替尼
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