凡德他尼的生物活性_凡德他尼实验方法
发布时间：2018-10-18 20:57:45 编辑作者：活性小子
图片：凡德他尼结构式
凡德他尼是一种癌症药物，可以干扰体内癌细胞的生长和扩散，用于治疗甲状腺癌。
一、凡德他尼的生物活性详解：
1）体外活性
凡德他尼抑制VEGFR3和EGFR，IC50分别为110 nM和500 nM。凡德他尼对PDGFRβ，Flt1，Tie-2和FGFR1不敏感，IC50为1.1-3.6μM，而对ICK，CDK2，c-Kit，erbB2，FAK，PDK1，Akt和IGF-1R几乎没有活性，IC50高于10μM。 凡德他尼抑制VEGF，EGF和bFGF刺激的HUVEC增殖，IC50为60 nM，170 nM和800 nM，对基底内皮细胞生长无影响。 凡德他尼抑制肿瘤细胞生长，IC50为2.7μM（A549）至13.5μM（Calu-6）[1]。与同一试验中的Cat S抑制剂LHVS（IC50 =0.001μM）相比，Odanacatib是抗原呈递的弱抑制剂，在小鼠B细胞系中测量（IC50 = 1.5±0.4μM）。与LHVS相比，Odanacatib还显示对小鼠脾细胞中MHC II恒定链蛋白Iip10的加工的抑制作用较弱（最小抑制浓度分别为1-10μM和0.01μM）[2]。 凡德他尼抑制HUVEC中VEGFR-2的磷酸化和肝癌细胞中EGFR的磷酸化并抑制细胞增殖[4]。
凡德他尼抑制VEGF-，EGF- 和 bFGF-刺激的HUVEC增殖，IC50分别为60 nM，170 nM和800 nM，而对基底内皮细胞生长几乎没有作用效果。凡德他尼也抑制VEGFR3和EGFR，IC50分别为110 nM 和500 nM。凡德他尼抑制肿瘤细胞生长，IC50为2.7 μM (A549) 到13.5 μM (Calu-6)。凡德他尼抑制basal ABCG2-ATP酶。EGFR抑制剂处理A431细胞，降低pEGFR水平，而凡德他尼处理时，抑制效果温和。凡德他尼抑制PC3wt和PC3R细胞系，IC50分别为13.3 μM和11.5 μM。凡德他尼抑制肝癌细胞中HUVEC和EGFR中VEGFR2的磷酸化并抑制细胞增殖。凡德他尼导致GEO和OVCAR-3细胞中G0-G1期细胞的积累，并增加OVCAR-3，ZR-75-1，MCF-10A ras和GEO细胞的凋亡。凡德他尼作用于有功能性EGFR但是缺失VEGFR-2的人类细胞系 (乳腺，结肠，胃和卵巢)，抑制软琼脂生长，这种作用具有剂量依赖性。凡德他尼在小鼠NIH-EGFR成纤维细胞和人MCF-10A ras乳腺癌细胞（过表达人EGFR的两种细胞系）中引起EGFR磷酸化的剂量依赖性抑制。
2）体内活性
凡德他尼（15 mg / kg，p.o。）在H1650异种移植模型中具有优于吉非替尼的抗肿瘤效果，并抑制肿瘤生长，IC50为3.5±1.2μM[3]。 在荷瘤小鼠中，凡德他尼（50或75 mg / kg）抑制肿瘤组织中VEGFR-2和EGFR的磷酸化，显着降低肿瘤血管密度，增强肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，提高存活率，减少肝内转移的数量 ，并在肿瘤组织中上调VEGF，TGF-α和EGF [4]。
PC3R异种移植物中，低剂量凡德他尼（25 mg/kg）相对于对照没有明显作用，而高剂量（50 mg/kg）与对照相比显著抑制肿瘤生长。相反，凡德他尼 50 mg/kg 和Docetaxel 30 mg/kg 按高剂量联用作用于PC3R细胞，显示明显的负相互作用。在荷瘤小鼠中，凡德他尼抑制肿瘤组织中VEGFR2和EGFR的磷酸化，显著降低肿瘤血管密度，增强肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，提高存活率，减少肝内转移瘤数量，并上调VEGF，TGF-α和EGF在肿瘤组织中的表达。凡德他尼作用于携带GEO结肠癌移植瘤(对EGFR信号受抑制敏感)的裸鼠，剂量依赖性抑制肿瘤生长。静脉注射2.5 mg/kg 凡德他尼逆转 63%血管内皮生长因子诱导的低血压，但是不会明显影响bFGF诱导的低血压。100 mg/kg 凡德他尼抑制79%肿瘤诱导的血管形成。
二、凡德他尼的生物活性实验方法：
1）细胞实验
通过改良的MTT测定法测量生长抑制。 简而言之，将细胞以每孔2000个细胞的密度接种在96孔板上，并暴露于每个吉非替尼或凡德他尼72小时。 每个测定一式三份进行。 将每种药物的50％抑制浓度（IC 50）确定为平均值±标准偏差（SD）。
2）动物实验
将100万个H1650细胞或H1650 / PTEN细胞（具有转染的PTEN基因的H1650细胞）皮下注射到每只小鼠的背部。 在注射后第10天，将小鼠随机分配至三组，其接受载体，凡德他尼（15mg / kg /天）或吉非替尼（15mg / kg /天）。 车辆，凡德他尼和吉非替尼每天口服给药一次，每周五次。 定期测定肿瘤体积（宽×宽×长/ 2）和体重。 肿瘤体积表示为平均值±SD。 使用Student's t检验评估肿瘤体积的差异。
3）激酶实验
激酶抑制：将凡德他尼与酶，10mM MnCl 2和2μMATP在涂有聚（Glu，Ala，Tyr）6：3：1无规共聚物底物的96孔板中温育。然后通过与小鼠IgG抗磷酸酪氨酸4G10抗体，辣根过氧化物酶连接的绵羊抗小鼠免疫球蛋白抗体和2,2'-连氮基 - 双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）的连续温育来检测磷酸化酪氨酸。该方法适用于检测与EGFR，PDGFRβ，Tie-2，FGFR1，c-kit，erbB2，IGF-1R和FAK相关的酪氨酸激酶的选择性。所有酶测定（酪氨酸或丝氨酸 - 苏氨酸）在相应的Km（0.2-14μM）或恰好低于相应的Km（0.2-14μM）时使用适当的ATP浓度。使用相关的闪烁亲近测定法（SPA）在96孔板中检查选择性与丝氨酸 - 苏氨酸激酶（CDK2，AKT和PDK1）的关系。 CDK2检测包含10 mMMnCl2,4.5μMATP，0.15μCi[γ-33 P] ATP /反应，50 mM HEPES（pH 7.5），1 mM DTT，0.1 mM原钒酸钠，0.1 mM氟化钠，10 mM甘油磷酸钠，1mg / mL BSA级分V和视网膜母细胞瘤基质（视网膜母细胞瘤基因的一部分，792-928，在谷胱甘肽S-转移酶表达系统中表达;0.22μM终浓度）。使反应在室温下进行60分钟，然后用150μL含有EDTA（62mM终浓度），3μg兔免疫球蛋白抗谷胱甘肽S-转移酶抗体和蛋白A SPA-聚乙烯基甲苯的溶液淬灭2小时。珠子（0.8mg /反应）。然后将板密封，离心（1200×g，5分钟），并在Microplate闪烁计数器上计数30秒。
综上所述：凡德他尼是一种有效的 VEGFR2 抑制剂，IC50 值为 40 nM。它的靶点活性为EGFR,500nM；VEGFR2,40nM；VEGFR3,110nM。
参考文献：
[1]. Wedge SR, et al. ZD6474 inhibits vascular endothelial growth factor signaling, angiogenesis, and tumor growth following oral administration. Cancer Res. 2002 Aug 15;62(16):4645-55.
[2]. Hegedus C, et al. Interaction of the EGFR inhibitors gefitinib, vandetanib, pelitinib and neratinib with the ABCG2 multidrug transporter: implications for the emergence and reversal of cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 2012 Aug 1;84(3):260-7.
[3]. Takeda H, et al. Vandetanib is effective in EGFR-mutant lung cancer cells with PTEN deficiency. Exp Cell Res. 2013 Feb 15;319(4):417-23.
[4]. Inoue K, et al. Vandetanib, an inhibitor of VEGF receptor-2 and EGF receptor, suppresses tumor development and improves prognosis of liver cancer in mice. Clin Cancer Res. 2012 Jul 15;18(14):3924-33.
一、凡德他尼的生物活性详解：
1）体外活性
凡德他尼抑制VEGFR3和EGFR，IC50分别为110 nM和500 nM。凡德他尼对PDGFRβ，Flt1，Tie-2和FGFR1不敏感，IC50为1.1-3.6μM，而对ICK，CDK2，c-Kit，erbB2，FAK，PDK1，Akt和IGF-1R几乎没有活性，IC50高于10μM。 凡德他尼抑制VEGF，EGF和bFGF刺激的HUVEC增殖，IC50为60 nM，170 nM和800 nM，对基底内皮细胞生长无影响。 凡德他尼抑制肿瘤细胞生长，IC50为2.7μM（A549）至13.5μM（Calu-6）[1]。与同一试验中的Cat S抑制剂LHVS（IC50 =0.001μM）相比，Odanacatib是抗原呈递的弱抑制剂，在小鼠B细胞系中测量（IC50 = 1.5±0.4μM）。与LHVS相比，Odanacatib还显示对小鼠脾细胞中MHC II恒定链蛋白Iip10的加工的抑制作用较弱（最小抑制浓度分别为1-10μM和0.01μM）[2]。 凡德他尼抑制HUVEC中VEGFR-2的磷酸化和肝癌细胞中EGFR的磷酸化并抑制细胞增殖[4]。
凡德他尼抑制VEGF-，EGF- 和 bFGF-刺激的HUVEC增殖，IC50分别为60 nM，170 nM和800 nM，而对基底内皮细胞生长几乎没有作用效果。凡德他尼也抑制VEGFR3和EGFR，IC50分别为110 nM 和500 nM。凡德他尼抑制肿瘤细胞生长，IC50为2.7 μM (A549) 到13.5 μM (Calu-6)。凡德他尼抑制basal ABCG2-ATP酶。EGFR抑制剂处理A431细胞，降低pEGFR水平，而凡德他尼处理时，抑制效果温和。凡德他尼抑制PC3wt和PC3R细胞系，IC50分别为13.3 μM和11.5 μM。凡德他尼抑制肝癌细胞中HUVEC和EGFR中VEGFR2的磷酸化并抑制细胞增殖。凡德他尼导致GEO和OVCAR-3细胞中G0-G1期细胞的积累，并增加OVCAR-3，ZR-75-1，MCF-10A ras和GEO细胞的凋亡。凡德他尼作用于有功能性EGFR但是缺失VEGFR-2的人类细胞系 (乳腺，结肠，胃和卵巢)，抑制软琼脂生长，这种作用具有剂量依赖性。凡德他尼在小鼠NIH-EGFR成纤维细胞和人MCF-10A ras乳腺癌细胞（过表达人EGFR的两种细胞系）中引起EGFR磷酸化的剂量依赖性抑制。
2）体内活性
凡德他尼（15 mg / kg，p.o。）在H1650异种移植模型中具有优于吉非替尼的抗肿瘤效果，并抑制肿瘤生长，IC50为3.5±1.2μM[3]。 在荷瘤小鼠中，凡德他尼（50或75 mg / kg）抑制肿瘤组织中VEGFR-2和EGFR的磷酸化，显着降低肿瘤血管密度，增强肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，提高存活率，减少肝内转移的数量 ，并在肿瘤组织中上调VEGF，TGF-α和EGF [4]。
PC3R异种移植物中，低剂量凡德他尼（25 mg/kg）相对于对照没有明显作用，而高剂量（50 mg/kg）与对照相比显著抑制肿瘤生长。相反，凡德他尼 50 mg/kg 和Docetaxel 30 mg/kg 按高剂量联用作用于PC3R细胞，显示明显的负相互作用。在荷瘤小鼠中，凡德他尼抑制肿瘤组织中VEGFR2和EGFR的磷酸化，显著降低肿瘤血管密度，增强肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，提高存活率，减少肝内转移瘤数量，并上调VEGF，TGF-α和EGF在肿瘤组织中的表达。凡德他尼作用于携带GEO结肠癌移植瘤(对EGFR信号受抑制敏感)的裸鼠，剂量依赖性抑制肿瘤生长。静脉注射2.5 mg/kg 凡德他尼逆转 63%血管内皮生长因子诱导的低血压，但是不会明显影响bFGF诱导的低血压。100 mg/kg 凡德他尼抑制79%肿瘤诱导的血管形成。
二、凡德他尼的生物活性实验方法：
1）细胞实验
通过改良的MTT测定法测量生长抑制。 简而言之，将细胞以每孔2000个细胞的密度接种在96孔板上，并暴露于每个吉非替尼或凡德他尼72小时。 每个测定一式三份进行。 将每种药物的50％抑制浓度（IC 50）确定为平均值±标准偏差（SD）。
2）动物实验
将100万个H1650细胞或H1650 / PTEN细胞（具有转染的PTEN基因的H1650细胞）皮下注射到每只小鼠的背部。 在注射后第10天，将小鼠随机分配至三组，其接受载体，凡德他尼（15mg / kg /天）或吉非替尼（15mg / kg /天）。 车辆，凡德他尼和吉非替尼每天口服给药一次，每周五次。 定期测定肿瘤体积（宽×宽×长/ 2）和体重。 肿瘤体积表示为平均值±SD。 使用Student's t检验评估肿瘤体积的差异。
3）激酶实验
激酶抑制：将凡德他尼与酶，10mM MnCl 2和2μMATP在涂有聚（Glu，Ala，Tyr）6：3：1无规共聚物底物的96孔板中温育。然后通过与小鼠IgG抗磷酸酪氨酸4G10抗体，辣根过氧化物酶连接的绵羊抗小鼠免疫球蛋白抗体和2,2'-连氮基 - 双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）的连续温育来检测磷酸化酪氨酸。该方法适用于检测与EGFR，PDGFRβ，Tie-2，FGFR1，c-kit，erbB2，IGF-1R和FAK相关的酪氨酸激酶的选择性。所有酶测定（酪氨酸或丝氨酸 - 苏氨酸）在相应的Km（0.2-14μM）或恰好低于相应的Km（0.2-14μM）时使用适当的ATP浓度。使用相关的闪烁亲近测定法（SPA）在96孔板中检查选择性与丝氨酸 - 苏氨酸激酶（CDK2，AKT和PDK1）的关系。 CDK2检测包含10 mMMnCl2,4.5μMATP，0.15μCi[γ-33 P] ATP /反应，50 mM HEPES（pH 7.5），1 mM DTT，0.1 mM原钒酸钠，0.1 mM氟化钠，10 mM甘油磷酸钠，1mg / mL BSA级分V和视网膜母细胞瘤基质（视网膜母细胞瘤基因的一部分，792-928，在谷胱甘肽S-转移酶表达系统中表达;0.22μM终浓度）。使反应在室温下进行60分钟，然后用150μL含有EDTA（62mM终浓度），3μg兔免疫球蛋白抗谷胱甘肽S-转移酶抗体和蛋白A SPA-聚乙烯基甲苯的溶液淬灭2小时。珠子（0.8mg /反应）。然后将板密封，离心（1200×g，5分钟），并在Microplate闪烁计数器上计数30秒。
综上所述：凡德他尼是一种有效的 VEGFR2 抑制剂，IC50 值为 40 nM。它的靶点活性为EGFR,500nM；VEGFR2,40nM；VEGFR3,110nM。
参考文献：
[1]. Wedge SR, et al. ZD6474 inhibits vascular endothelial growth factor signaling, angiogenesis, and tumor growth following oral administration. Cancer Res. 2002 Aug 15;62(16):4645-55.
[2]. Hegedus C, et al. Interaction of the EGFR inhibitors gefitinib, vandetanib, pelitinib and neratinib with the ABCG2 multidrug transporter: implications for the emergence and reversal of cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 2012 Aug 1;84(3):260-7.
[3]. Takeda H, et al. Vandetanib is effective in EGFR-mutant lung cancer cells with PTEN deficiency. Exp Cell Res. 2013 Feb 15;319(4):417-23.
[4]. Inoue K, et al. Vandetanib, an inhibitor of VEGF receptor-2 and EGF receptor, suppresses tumor development and improves prognosis of liver cancer in mice. Clin Cancer Res. 2012 Jul 15;18(14):3924-33.
相关化合物：凡德他尼
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