| 描述 |
EPZ004777 是一种有效的选择性 DOT1L 抑制剂,IC50 为 0.4 nM。
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| 相关类别 |
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| 靶点 |
IC50: 0.4 nM (DOT1L)[1]
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| 体外研究 |
EPZ004777证明了DOT1L酶活性的有效浓度依赖性抑制,IC50为400±100pM。与其他HMT(PRMT5,521±137nM;其他,>50μM)相比,EPZ004777对DOT1L的抑制具有显着的选择性。延长的EPZ004777治疗的效果对于MLL重排细胞系是非常特异的。 EPZ004777显着降低了活MV4-11和MOLM-13细胞的数量,而Jurkat细胞的生长未受影响。在EPZ004777存在的情况下,少量MV4-11细胞仍然存活,但是当长时间跟踪生长曲线表明它们已经停止分裂时,它们的数量保持不变。 EPZ004777在浓度为3μM或更高时强烈抑制MLL-AF9转化细胞的增殖[1]。 EPZ004777选择性抑制MLL-AF10和CALM-AF10转化的小鼠骨髓细胞的增殖[2]。
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| 体内研究 |
EPZ004777耐受性良好,未观察到明显的毒性。连续暴露于EPZ004777 14天后的全血细胞计数分析显示总白细胞计数的统计学显着增加,其由中性粒细胞,单核细胞和淋巴细胞的增加引起。 EPZ004777(50,100或150 mg/mL)给药耐受性良好,未观察到明显的体重减轻[1]。
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| 激酶实验 |
纯化禽（鸡）红细胞寡核小体。将EPZ004777在DMSO中连续稀释3倍，总共10个浓度，从1μM开始。将1μL等分试样的每种抑制剂稀释液涂布在384孔微量滴定板中。 100％抑制对照由2.5μM终产物浓度的产物抑制剂S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH）组成。将化合物与40μL/孔的0.25nM DOT1L（1-416）在测定缓冲液（20mM TRIS [pH 8.0] 10mM NaCl，0.002％吐温20,0.005％牛皮明胶，100mM KCl）中孵育30分钟，和0.5mM DTT）。每孔加入10μL底物混合物，其包含含有200nM 3H-SAM（80Ci / mmol），600nM未标记SAM和20nM核小体的测定缓冲液以引发反应（两种底物都存在于最终反应混合物中相应的KM值，称为“平衡条件”的测定形式。将反应物温育120分钟并用每孔10μL的800μMSAM终止。在闪光板中测量放射性在核小体底物中的掺入。在相似的平衡测定条件下测定组蛋白甲基转移酶组，其中SAM和蛋白质/肽底物的浓度均等于它们各自的KM值[1]。
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| 细胞实验 |
为了评估人细胞系中的细胞增殖和活力，将指数生长的细胞一式三份地以3×10 4个细胞/孔的密度接种在96孔板中，最终体积为150μL。将细胞在3μM（增殖曲线）或EPZ004777的增加浓度（IC50测定）存在下孵育至50μM。使用Guava Viacount测定法每3-4天测定活细胞数，持续18天，并在Guava EasyCyte Plus仪器上分析。在细胞计数的天数，更换生长培养基和EPZ004777并将细胞分裂回5×104细胞/孔的密度。总细胞数表示为每孔分裂调节的活细胞。对于每个细胞系，使用Graphpad Prism软件从每个时间点的浓度依赖性曲线确定IC 50值。确定IC 50值的实验持续到IC 50值稳定（THP-1细胞第18天，所有其他细胞系第14天）[1]。
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| 动物实验 |
小鼠[1]将9周龄雌性裸鼠（nu / nu）皮下注射右侧腹侧的MV4-11细胞（200μL5×107细胞/ mL悬浮液，在PBS的1：1混合物中）基质胶）。当肿瘤大小达到300-400mm 3时，将小鼠随机分配到治疗组。六只小鼠接受渗透泵的皮下植入，在10％乙醇，90％水中含有50mg / mL EPZ004777，并且五只对照小鼠未接受泵植入。泵植入后6天，处死动物并收集来自处理动物和对照动物的肿瘤样品用于免疫印迹分析。对于播散性白血病模型，用pMMP-LucNeo逆转录病毒转导MV4-11细胞。 8周龄雌性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wj1 / SzJ（NSG）小鼠购自Jackson Laboratories。通过侧尾静脉静脉注射总共1×107个MV4-11-LucNeo细胞。在注射75mg / kg D-荧光素后，通过生物发光成像确定播散性白血病的植入。将具有记录的白血病的动物分成由载体（15％乙醇，50％PEG300,35％水）负载的渗透泵或50,100或150mg / mL的EPZ004777组成的治疗组。渗透泵在一周后更换。在100和150mg / mL剂量组中观察到由化合物沉淀引起的刺激，排除了额外的泵替代。每天监测动物的临床症状，并且当它们显示与终末白血病疾病一致的痛苦迹象时实施安乐死。对数秩分析用于确定存活曲线的统计显着性。
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| 参考文献 |
[1]. Daigle SR, et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 2011 Jul 12;20(1):53-65. [2]. Chen L, et al. Abrogation of MLL-AF10 and CALM-AF10-mediated transformation through genetic inactivation or pharmacological inhibition of the H3K79 methyltransferase Dot1l. Leukemia. 2013 Apr;27(4):813-22.
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