坦度替尼的作用和生物活性
发布时间：2018-11-01 21:59:58 编辑作者：活性达人
图片：坦度替尼结构式
坦度替尼是一种具有抗肿瘤活性的哌嗪基喹唑啉受体酪氨酸激酶抑制剂。坦度替尼抑制FLT3（FMS样酪氨酸激酶-3），c-KIT和PDGF（血小板衍生生长因子）受体酪氨酸激酶的自磷酸化，从而抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。那么坦度替尼的生物活性是什么？如何做实验呢？简单来说，坦度替尼是FLT3拮抗剂，IC50为0.22μM，还抑制PDGFR和c-Kit。下面让小编给您详细说明。
首先我们介绍坦度替尼的生物活性：
1）体外活性
与星孢菌素不同，坦度替尼对βPDGF，FLT3和c-Kit自磷酸化具有较好的抑制效果（IC50：0.17-0.22μM）,但几乎不影响EGFR,FGFR,KDR,InsR,Src,Abl,PKC,PKA,和MAPKs。由于对FLT3抑制的特异性，坦度替尼只对FLT3-ITD阳性Molm-14细胞有效，对FLT3-ITD阴性THP-1细胞无效果，处理24和96h，造成的细胞凋亡分别为51%和78%。
坦度替尼对含FLT3-ITD突变的人白血病Ba/F3细胞增殖也有抑制作用（IC50：10-30nM），还抑制FLT3-ITD-阳性的Molm-13和14细胞（IC50：10nM）。与AML的ITD阴性患者相比，坦度替尼优先抑制AML的FLT3ITD阳性患者体内爆发式的集落生长，但对正常人祖细胞形成集落没有影响。坦度替尼对不依赖IL-3的细胞生长具有抑制作用，同时抑制FLT3-ITD自磷酸化（IC50：10-100nM）。
在FLT3-ITD阳性的Molm-14细胞而不是FLT3-ITD阴性的THP-1细胞中，由于特异性的FLT3抑制作用，坦度替尼处理在24小时和96小时分别导致51％和78％的显着细胞凋亡[1]]。与ITD阴性的AML患者相比，坦度替尼优先抑制FLT3ITD阳性胚细胞集落的生长，而不影响正常人祖细胞的集落形成[2]。
2）体内活性
在携带表达W51FLT3-ITD突变型Ba/F3细胞的小鼠中，坦度替尼（60mg/kg，2次/天，p.o.）可显著延长寿命,而在小鼠骨髓移植模型中，其可使死亡率显著降低。坦度替尼（180mg/kg，2次/天）对正常造血功能有轻微毒性，作用于小鼠时，对FLT3ITD-阳性的白血病有良好的治疗效果。
口服施用60mg/kgbid的坦度替尼可显着提高携带表达W51FLT3-ITD突变体的Ba/F3细胞的小鼠的存活率，并使小鼠骨髓移植模型的死亡率显着降低[1]。每天两次180mg/kg的坦度替尼治疗对正常的造血有轻微的毒性，然而，它是坦度替尼有效治疗小鼠FLT3ITD阳性白血病的剂量[2]。
我们已经了解了它的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：
1）动物实验
实验模型：注射表达W51FLT3-ITD突变体的Ba/F3细胞的Feathymic裸（nu/nu）小鼠。
2）细胞实验
将细胞暴露于递增浓度的坦度替尼（0.004-30μM）。细胞在组织培养物中生长3-7天，并计数通过台盼蓝染料排除法测定的活细胞。每天一次，收获细胞，洗涤并重悬于含有10mMHEPES（pH7.4），140mMNaCl和2.5mMCaCl2的100uL结合缓冲液中。
将膜联蛋白V-FITC（100ng）和碘化丙锭（250ng）加入细胞悬浮液中，然后在室温下温育15分钟。在FACSort流式细胞仪上染色后立即进行流式细胞术，激发波长为488nm。膜联蛋白V-FITC和DNA碘化丙锭染色的荧光分别在515nm和585nm处测量。
3）激酶实验
基于细胞的受体自身磷酸化测定：PDGFR家族激酶测定的自磷酸化是基于细胞的酶联免疫吸附（ELISA）测定，其使用表达野生型PDGFRβ，嵌合蛋白PDGFRβ/c-Kit和PDGFRβ/Flt3的CHO细胞，其含有细胞外和PDGFRβ的跨膜结构域和c-Kit的细胞质结构域和Flt-3。在标准组织培养条件下使细胞在96孔微量滴定板中生长至汇合，然后血清饥饿16小时。
简言之，将静止细胞在37℃下与递增浓度的坦度替尼一起孵育30分钟，然后加入8nMPDGF-BB10分钟。将细胞在100mMTris，pH7.5,750mMNaCl，0.5％TritonX-100,10mM焦磷酸钠，50mMNaF，10μg/mL抑肽酶，10μg/mL亮抑酶肽，1mM苯甲基磺酰氟，1mM中裂解。钒酸钠，通过以15,000g离心5分钟澄清裂解物。将澄清的裂解物转移到第二微量滴定板中，其中孔预先用500ng/孔的1B5B11抗PDGFRβmAb包被，然后在室温下温育2小时。用结合缓冲液（0.3％明胶，25mMHEPES，pH7.5,100mMNaCl，0.01％吐温20）洗涤三次后，加入250ng/mL兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗体，并将板在37℃温育。60分钟。随后，用结合缓冲液将每个孔洗涤三次，并与1μg/mL辣根过氧化物酶缀合的抗兔抗体在37℃温育60分钟。在加入2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）之前洗涤孔，并在650nm监测底物形成速率。
今天介绍了坦度替尼的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。小编给您做一个总结：坦度替尼是一种有效的FLT3拮抗剂（IC50：0.22μM），也可以抑制c-Kit和PDGFR，FLT3对CSF-1R的效力提高15-20倍，对同一靶标的选择性比FGFR，EGFR和KDR提高不止100倍。它的靶点活性为c-Kit,0.17μM；CSF-1R,3.43μM；FLT3,0.22μM；PDGFRβ,0.20μM；Src,30μM
您可能想了解坦度替尼的物理化学性质https://www.chemsrc.com/cas/387867-13-2_894729.html。如果您有其他资讯方面的需求，请和化源网联系。
参考文献：
[1]. Kelly LM, et al. CT53518, a novel selective FLT3 antagonist for the treatment of acute myelogenous leukemia (AML). Cancer Cell, 2002, 1(5), 421-432.
[2]. Griswold IJ, et al. Effects of MLN518, a dual FLT3 and KIT inhibitor, on normal and malignant hematopoiesis. Blood, 2004, 104(9), 2912-2918.
[3]. Schittenhelm MM, et al. The FLT3 inhibitor tandutinib (formerly MLN518) has sequence-independent synergistic effects with cytarabine and daunorubicin. Cell Cycle, 2009, 8(16), 2621-2630.
[4]. Salama Y, et al. The angiogenic factor Egfl7 alters thymogenesis by activating Flt3 signaling. Biochem Biophys Res Commun. 2017 Aug 19;490(2):209-216.
首先我们介绍坦度替尼的生物活性：
1）体外活性
与星孢菌素不同，坦度替尼对βPDGF，FLT3和c-Kit自磷酸化具有较好的抑制效果（IC50：0.17-0.22μM）,但几乎不影响EGFR,FGFR,KDR,InsR,Src,Abl,PKC,PKA,和MAPKs。由于对FLT3抑制的特异性，坦度替尼只对FLT3-ITD阳性Molm-14细胞有效，对FLT3-ITD阴性THP-1细胞无效果，处理24和96h，造成的细胞凋亡分别为51%和78%。
坦度替尼对含FLT3-ITD突变的人白血病Ba/F3细胞增殖也有抑制作用（IC50：10-30nM），还抑制FLT3-ITD-阳性的Molm-13和14细胞（IC50：10nM）。与AML的ITD阴性患者相比，坦度替尼优先抑制AML的FLT3ITD阳性患者体内爆发式的集落生长，但对正常人祖细胞形成集落没有影响。坦度替尼对不依赖IL-3的细胞生长具有抑制作用，同时抑制FLT3-ITD自磷酸化（IC50：10-100nM）。
在FLT3-ITD阳性的Molm-14细胞而不是FLT3-ITD阴性的THP-1细胞中，由于特异性的FLT3抑制作用，坦度替尼处理在24小时和96小时分别导致51％和78％的显着细胞凋亡[1]]。与ITD阴性的AML患者相比，坦度替尼优先抑制FLT3ITD阳性胚细胞集落的生长，而不影响正常人祖细胞的集落形成[2]。
2）体内活性
在携带表达W51FLT3-ITD突变型Ba/F3细胞的小鼠中，坦度替尼（60mg/kg，2次/天，p.o.）可显著延长寿命,而在小鼠骨髓移植模型中，其可使死亡率显著降低。坦度替尼（180mg/kg，2次/天）对正常造血功能有轻微毒性，作用于小鼠时，对FLT3ITD-阳性的白血病有良好的治疗效果。
口服施用60mg/kgbid的坦度替尼可显着提高携带表达W51FLT3-ITD突变体的Ba/F3细胞的小鼠的存活率，并使小鼠骨髓移植模型的死亡率显着降低[1]。每天两次180mg/kg的坦度替尼治疗对正常的造血有轻微的毒性，然而，它是坦度替尼有效治疗小鼠FLT3ITD阳性白血病的剂量[2]。
我们已经了解了它的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：
1）动物实验
实验模型：注射表达W51FLT3-ITD突变体的Ba/F3细胞的Feathymic裸（nu/nu）小鼠。
2）细胞实验
将细胞暴露于递增浓度的坦度替尼（0.004-30μM）。细胞在组织培养物中生长3-7天，并计数通过台盼蓝染料排除法测定的活细胞。每天一次，收获细胞，洗涤并重悬于含有10mMHEPES（pH7.4），140mMNaCl和2.5mMCaCl2的100uL结合缓冲液中。
将膜联蛋白V-FITC（100ng）和碘化丙锭（250ng）加入细胞悬浮液中，然后在室温下温育15分钟。在FACSort流式细胞仪上染色后立即进行流式细胞术，激发波长为488nm。膜联蛋白V-FITC和DNA碘化丙锭染色的荧光分别在515nm和585nm处测量。
3）激酶实验
基于细胞的受体自身磷酸化测定：PDGFR家族激酶测定的自磷酸化是基于细胞的酶联免疫吸附（ELISA）测定，其使用表达野生型PDGFRβ，嵌合蛋白PDGFRβ/c-Kit和PDGFRβ/Flt3的CHO细胞，其含有细胞外和PDGFRβ的跨膜结构域和c-Kit的细胞质结构域和Flt-3。在标准组织培养条件下使细胞在96孔微量滴定板中生长至汇合，然后血清饥饿16小时。
简言之，将静止细胞在37℃下与递增浓度的坦度替尼一起孵育30分钟，然后加入8nMPDGF-BB10分钟。将细胞在100mMTris，pH7.5,750mMNaCl，0.5％TritonX-100,10mM焦磷酸钠，50mMNaF，10μg/mL抑肽酶，10μg/mL亮抑酶肽，1mM苯甲基磺酰氟，1mM中裂解。钒酸钠，通过以15,000g离心5分钟澄清裂解物。将澄清的裂解物转移到第二微量滴定板中，其中孔预先用500ng/孔的1B5B11抗PDGFRβmAb包被，然后在室温下温育2小时。用结合缓冲液（0.3％明胶，25mMHEPES，pH7.5,100mMNaCl，0.01％吐温20）洗涤三次后，加入250ng/mL兔多克隆抗磷酸酪氨酸抗体，并将板在37℃温育。60分钟。随后，用结合缓冲液将每个孔洗涤三次，并与1μg/mL辣根过氧化物酶缀合的抗兔抗体在37℃温育60分钟。在加入2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）之前洗涤孔，并在650nm监测底物形成速率。
今天介绍了坦度替尼的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。小编给您做一个总结：坦度替尼是一种有效的FLT3拮抗剂（IC50：0.22μM），也可以抑制c-Kit和PDGFR，FLT3对CSF-1R的效力提高15-20倍，对同一靶标的选择性比FGFR，EGFR和KDR提高不止100倍。它的靶点活性为c-Kit,0.17μM；CSF-1R,3.43μM；FLT3,0.22μM；PDGFRβ,0.20μM；Src,30μM
您可能想了解坦度替尼的物理化学性质https://www.chemsrc.com/cas/387867-13-2_894729.html。如果您有其他资讯方面的需求，请和化源网联系。
参考文献：
[1]. Kelly LM, et al. CT53518, a novel selective FLT3 antagonist for the treatment of acute myelogenous leukemia (AML). Cancer Cell, 2002, 1(5), 421-432.
[2]. Griswold IJ, et al. Effects of MLN518, a dual FLT3 and KIT inhibitor, on normal and malignant hematopoiesis. Blood, 2004, 104(9), 2912-2918.
[3]. Schittenhelm MM, et al. The FLT3 inhibitor tandutinib (formerly MLN518) has sequence-independent synergistic effects with cytarabine and daunorubicin. Cell Cycle, 2009, 8(16), 2621-2630.
[4]. Salama Y, et al. The angiogenic factor Egfl7 alters thymogenesis by activating Flt3 signaling. Biochem Biophys Res Commun. 2017 Aug 19;490(2):209-216.
相关化合物：坦度替尼
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