苹果酸卡博替尼的作用和生物活性
发布时间：2018-11-08 14:54:41 编辑作者：活性达人
图片：卡博替尼苹果酸盐结构式
苹果酸卡博替尼是卡博替尼的s-苹果酸盐形式，又叫卡博替尼苹果酸盐。它是一种口服生物可利用的小分子受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。那么它的生物活性是什么？如何做实验呢？下面让小编给您详细说明。
首先我们介绍苹果酸卡博替尼的生物活性：
1）体外活性
卡博替尼对RON和PDGFRβ的抑制活性较弱，IC50分别为124nM和234nM，对FGFR1的活性较低，IC50为5.294μM。低浓度（0.1-0.5μM）的卡博替尼足以诱导组成型和诱导型Met磷酸化的显着抑制及其在MPNST细胞中产生的下游信号传导，并抑制HGF诱导的MPNST细胞迁移和侵袭。
卡博替尼（0.1-0.5μM）抑制所有MPNST细胞中的组成型和诱导型MET磷酸化及其产生的下游信号传导。它（>0.1μM）引起显着的MPNST细胞生长抑制；需要更高的苹果酸卡博替尼剂量来抑制NSC生长。博替尼还诱导细胞因子刺激的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中Met和VEGFR2磷酸化的显着抑制。虽然卡博替尼对0.1μM的MPNST细胞生长没有显着影响，但卡博替尼在5-10μM时显着抑制MPNST细胞生长。
在细胞试验中，卡博替尼抑制MET和VEGFR2以及KIT，FLT3和AXL的磷酸化，IC50值分别为7.8,1.9,5.0,7.5和42μM。卡博替尼还响应来自MDA-MB-231（IC50=5.1nM），A431（IC50=4.1nM），HT1080（IC50=7.7nM）和B16F10（IC50=4.7nM）培养物的条件培养基抑制小管形成细胞[3]。
2）体内活性
卡博替尼（60mg/kg，i.p。）降低肿瘤血管分布，在动物中减少范围从3mg/kg的67％到30mg/kg的83％。与载体的相应值相比，在10周龄开始处理7天的RIP-Tag2小鼠中的肿瘤在XL880后小40％，在卡博替尼后小35％。卡博替尼（30mg/kg）显着降低小鼠的微血管密度[2]。
卡博替尼（100mg/kg，口服）抑制体内刺激肝脏肝细胞中HGF的MET磷酸化和VEGF刺激的FLK1磷酸化，同时抑制持续8小时后的两种靶标。卡博替尼（100mg/kg，口服）破坏肿瘤血管系统并促进肿瘤和内皮细胞死亡。卡博替尼（1-60mg/kg，口服）抑制肿瘤生长并促进体内肿瘤消退[3]。
在具有自发性胰岛肿瘤的RIP-Tag2小鼠中以30mg/kg的卡博替尼治疗破坏了83％的肿瘤脉管系统，减少了周细胞和空基底膜套管，引起广泛的肿瘤内缺氧和广泛的肿瘤细胞凋亡，并且减缓了肿瘤血管的再生停药后，与阻断VEGFR但不阻断c-Met的XL999相比，更显着，导致血管分布仅减少43％，表明VEGFR和其他功能相关的受体酪氨酸激酶（RTK）的同时抑制可放大血管生成抑制。
卡博替尼还可降低原发肿瘤的侵袭性并减少转移。[1]30mg/kg/天的卡博替尼显着消除了SCID小鼠中人MPNST异种移植物的生长和转移。卡博替尼的给药诱导乳腺癌，肺癌和神经胶质瘤肿瘤模型中肿瘤生长的剂量依赖性抑制，与肿瘤和内皮细胞增殖减少以及细胞凋亡增加有关。单次口服剂量的卡博替尼足以在100mg/kg和10mg/kg的MDA-MB-231荷瘤小鼠和携带C6肿瘤的大鼠中诱导持续的肿瘤生长抑制。
我们已经了解了它的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：
1）动物实验
将H441细胞（3×106）皮内植入后胁腹，当肿瘤达到约150mg时，使用下式计算肿瘤重量:(肿瘤体积=长度（mm）×宽度2（mm2）]/2，小鼠随机分组（每组n=5）并口服单剂量100mg/kg剂量的卡博替尼或载体。在指定的时间点收集肿瘤。合并的肿瘤裂解物用抗MET（SC161）进行免疫沉淀，并用抗蛋白质印迹法进行免疫沉淀。印迹剥离后，将总MET定量为上样对照。
在另一个实验中，给予幼稚小鼠（每组n=5）单次100mg/kg剂量的卡博替尼或然后在收集肝脏前10分钟静脉内给予HGF（每只小鼠10μg）。肝脏裂解液中MET磷酸化的分析如上所述。在另一个实验中，幼稚小鼠（每组n=5）给予单一100mg/kg剂量的卡博替尼或载体，然后在肺采集前30分钟静脉内施用VEGF（每只小鼠10μg）。汇集的肺裂解物用FLK1（SC6251）进行免疫沉淀，并用抗磷酸酪氨酸（4G10）进行蛋白质印迹。印迹剥离后，定量总FLK1作为上样对照。
2）细胞实验
将细胞暴露于各种浓度的卡博替尼48小时。使用CellTiter96水性非放射性细胞增殖测定试剂盒通过MTS测定确定细胞生长。在490nm的波长下测量吸光度，并且处理的细胞的吸光度值表示为未处理细胞的吸光度的百分比。
3）激酶实验
使用荧光素酶偶联的化学发光，33P-磷酰基转移或AlphaScreen技术测定卡博替尼对270种人激酶的广泛组的抑制特性。使用重组人全长，谷胱甘肽S-转移酶标签或组氨酸标签融合蛋白，并通过测量在ATP浓度等于或低于该浓度的肽底物聚（Glu，Tyr）的磷酸化来确定半数最大抑制浓度（IC50）值。每种激酶的Km。通过测定一系列ATP浓度下的IC50值，使用AlphaScreenAssay评估激酶抑制的机制。
今天介绍了苹果酸卡博替尼的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，苹果酸卡博替尼是一种有效的 VEGFR2 抑制剂，IC50 值为 0.035 nM，同时能够抑制 c-Met，Ret，Kit，Flt-1/3/4，Tie2 和 AXL 的活性，IC50 值分别为 1.3 nM，4 nM，4.6 nM，12 nM/11.3 nM/6 nM，14.3 nM 和 7 nM。苹果酸卡博替尼的靶点活性为AXL,7.0nM；c-Met,1.3nM；Kit,4.6nM；VEGFR2/KDR,0.035nM；VEGFR3/FLT4,6.0nM。
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参考文献：
[1]. You WK, et al. VEGF and c-Met blockade amplify angiogenesis inhibition in pancreatic islet cancer. Cancer Res, 2011, 71(14), 4758-4768.
[2]. Torres KE, et al. Activated MET is a molecular prognosticator and potential therapeutic target for malignant peripheral nerve sheath tumors. Clin Cancer Res, 2011, 17(12), 3943-3955.
[3]. Yakes FM, et al. Cabozantinib (XL184), a novel MET and VEGFR2 inhibitor, simultaneously suppresses metastasis, angiogenesis, and tumor growth. Mol Cancer Ther, 2011, 10(12), 2298-2308.
首先我们介绍苹果酸卡博替尼的生物活性：
1）体外活性
卡博替尼对RON和PDGFRβ的抑制活性较弱，IC50分别为124nM和234nM，对FGFR1的活性较低，IC50为5.294μM。低浓度（0.1-0.5μM）的卡博替尼足以诱导组成型和诱导型Met磷酸化的显着抑制及其在MPNST细胞中产生的下游信号传导，并抑制HGF诱导的MPNST细胞迁移和侵袭。
卡博替尼（0.1-0.5μM）抑制所有MPNST细胞中的组成型和诱导型MET磷酸化及其产生的下游信号传导。它（>0.1μM）引起显着的MPNST细胞生长抑制；需要更高的苹果酸卡博替尼剂量来抑制NSC生长。博替尼还诱导细胞因子刺激的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中Met和VEGFR2磷酸化的显着抑制。虽然卡博替尼对0.1μM的MPNST细胞生长没有显着影响，但卡博替尼在5-10μM时显着抑制MPNST细胞生长。
在细胞试验中，卡博替尼抑制MET和VEGFR2以及KIT，FLT3和AXL的磷酸化，IC50值分别为7.8,1.9,5.0,7.5和42μM。卡博替尼还响应来自MDA-MB-231（IC50=5.1nM），A431（IC50=4.1nM），HT1080（IC50=7.7nM）和B16F10（IC50=4.7nM）培养物的条件培养基抑制小管形成细胞[3]。
2）体内活性
卡博替尼（60mg/kg，i.p。）降低肿瘤血管分布，在动物中减少范围从3mg/kg的67％到30mg/kg的83％。与载体的相应值相比，在10周龄开始处理7天的RIP-Tag2小鼠中的肿瘤在XL880后小40％，在卡博替尼后小35％。卡博替尼（30mg/kg）显着降低小鼠的微血管密度[2]。
卡博替尼（100mg/kg，口服）抑制体内刺激肝脏肝细胞中HGF的MET磷酸化和VEGF刺激的FLK1磷酸化，同时抑制持续8小时后的两种靶标。卡博替尼（100mg/kg，口服）破坏肿瘤血管系统并促进肿瘤和内皮细胞死亡。卡博替尼（1-60mg/kg，口服）抑制肿瘤生长并促进体内肿瘤消退[3]。
在具有自发性胰岛肿瘤的RIP-Tag2小鼠中以30mg/kg的卡博替尼治疗破坏了83％的肿瘤脉管系统，减少了周细胞和空基底膜套管，引起广泛的肿瘤内缺氧和广泛的肿瘤细胞凋亡，并且减缓了肿瘤血管的再生停药后，与阻断VEGFR但不阻断c-Met的XL999相比，更显着，导致血管分布仅减少43％，表明VEGFR和其他功能相关的受体酪氨酸激酶（RTK）的同时抑制可放大血管生成抑制。
卡博替尼还可降低原发肿瘤的侵袭性并减少转移。[1]30mg/kg/天的卡博替尼显着消除了SCID小鼠中人MPNST异种移植物的生长和转移。卡博替尼的给药诱导乳腺癌，肺癌和神经胶质瘤肿瘤模型中肿瘤生长的剂量依赖性抑制，与肿瘤和内皮细胞增殖减少以及细胞凋亡增加有关。单次口服剂量的卡博替尼足以在100mg/kg和10mg/kg的MDA-MB-231荷瘤小鼠和携带C6肿瘤的大鼠中诱导持续的肿瘤生长抑制。
我们已经了解了它的生物活性，接下来如何做活性实验呢？一般来说，有如下的三种方法：
1）动物实验
将H441细胞（3×106）皮内植入后胁腹，当肿瘤达到约150mg时，使用下式计算肿瘤重量:(肿瘤体积=长度（mm）×宽度2（mm2）]/2，小鼠随机分组（每组n=5）并口服单剂量100mg/kg剂量的卡博替尼或载体。在指定的时间点收集肿瘤。合并的肿瘤裂解物用抗MET（SC161）进行免疫沉淀，并用抗蛋白质印迹法进行免疫沉淀。印迹剥离后，将总MET定量为上样对照。
在另一个实验中，给予幼稚小鼠（每组n=5）单次100mg/kg剂量的卡博替尼或然后在收集肝脏前10分钟静脉内给予HGF（每只小鼠10μg）。肝脏裂解液中MET磷酸化的分析如上所述。在另一个实验中，幼稚小鼠（每组n=5）给予单一100mg/kg剂量的卡博替尼或载体，然后在肺采集前30分钟静脉内施用VEGF（每只小鼠10μg）。汇集的肺裂解物用FLK1（SC6251）进行免疫沉淀，并用抗磷酸酪氨酸（4G10）进行蛋白质印迹。印迹剥离后，定量总FLK1作为上样对照。
2）细胞实验
将细胞暴露于各种浓度的卡博替尼48小时。使用CellTiter96水性非放射性细胞增殖测定试剂盒通过MTS测定确定细胞生长。在490nm的波长下测量吸光度，并且处理的细胞的吸光度值表示为未处理细胞的吸光度的百分比。
3）激酶实验
使用荧光素酶偶联的化学发光，33P-磷酰基转移或AlphaScreen技术测定卡博替尼对270种人激酶的广泛组的抑制特性。使用重组人全长，谷胱甘肽S-转移酶标签或组氨酸标签融合蛋白，并通过测量在ATP浓度等于或低于该浓度的肽底物聚（Glu，Tyr）的磷酸化来确定半数最大抑制浓度（IC50）值。每种激酶的Km。通过测定一系列ATP浓度下的IC50值，使用AlphaScreenAssay评估激酶抑制的机制。
今天介绍了苹果酸卡博替尼的作用，并且详细地说明了它的生物活性和实验方法。综上所述，苹果酸卡博替尼是一种有效的 VEGFR2 抑制剂，IC50 值为 0.035 nM，同时能够抑制 c-Met，Ret，Kit，Flt-1/3/4，Tie2 和 AXL 的活性，IC50 值分别为 1.3 nM，4 nM，4.6 nM，12 nM/11.3 nM/6 nM，14.3 nM 和 7 nM。苹果酸卡博替尼的靶点活性为AXL,7.0nM；c-Met,1.3nM；Kit,4.6nM；VEGFR2/KDR,0.035nM；VEGFR3/FLT4,6.0nM。
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参考文献：
[1]. You WK, et al. VEGF and c-Met blockade amplify angiogenesis inhibition in pancreatic islet cancer. Cancer Res, 2011, 71(14), 4758-4768.
[2]. Torres KE, et al. Activated MET is a molecular prognosticator and potential therapeutic target for malignant peripheral nerve sheath tumors. Clin Cancer Res, 2011, 17(12), 3943-3955.
[3]. Yakes FM, et al. Cabozantinib (XL184), a novel MET and VEGFR2 inhibitor, simultaneously suppresses metastasis, angiogenesis, and tumor growth. Mol Cancer Ther, 2011, 10(12), 2298-2308.
相关化合物：卡博替尼苹果酸盐
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