雷帕霉素的生物活性和实验方法

雷帕霉素属大环内酯类抗生素，与普乐可复(FK506)的结构相似，但却有非常不同的免疫抑制机制。FK506抑制T淋巴细胞由G0期至G1期的增殖，而RAPA则通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，和FK506相比，RAPA可阻断T淋巴细胞和B淋巴细胞的钙依赖性和非钙依赖性的信号传导通路。

那么，雷帕霉素的生物活性是什么呢?
雷帕霉素是一种特异性的 mTOR 抑制剂，IC50 为 0.1 nM。它的生物活性如下：
In Vitro: 雷帕霉素对IC50为0.1nM的HEK293细胞内源性mTOR活性的抑制作用强于IC50分别为5nM和10nM的iRap和AP21667。雷帕霉素通过诱导自噬作用对恶性胶质瘤细胞发挥抗肿瘤作用，提示在恶性胶质瘤细胞中，PI3K/Akt信号通路的破坏可大大提高mTOR抑制剂的有效性。雷帕霉素以剂量依赖的方式抑制三种细胞系的细胞活力，但其敏感性不同。T98G、U87mg和U37 3-Mg细胞的IC50分别为2 nm、1μm和>25μm。
In Vivo: 雷帕霉素(i.p，1.5mg/kg)治疗在7天和14天时几乎完全防止足底肌肉重量和纤维大小的肥大性增加。每天给WT或LS/+小鼠注射雷帕霉素(2mg/kg体重i.p.)4周，然后每周再注射4周相同剂量的雷帕霉素。雷帕霉素处理的Ls/+小鼠心脏异常基因表达谱的显著逆转。

接下来，小编谈谈雷帕霉素的实验方法。
1. 激酶测定
HEK293细胞在12孔板的每个孔中镀2-2.5×105个细胞，血清仅在DMEM中饥饿24小时。用雷帕霉素(0.05-50nM)、iRap(0.5-500nM)或AP21967(0.5-500nM)对细胞进行模拟处理或处理，在37℃下15分钟。将溶解的蛋白质转移到PVDF膜上，用针对p70 S6激酶Thr389的磷酸特异性初级抗体进行免疫印迹。利用IMAGE和KaleIDAGRAH对数据进行分析。
2. 细胞分析
HL-60、NB4、U937、KG-1和K562细胞在添加10%热灭活FBS、2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的RPMI-1640中在37℃5%CO2加湿气氛中常规传代。浸渍，再悬浮于含有10%个FBS的新鲜培养基中。在不同浓度的DMSO或1μM ATRA存在下，以2×105/mL的初始细胞密度接种于BD Falcon 6孔板中。Rapamycin(20 nm)在分化剂之前加入20分钟。在第2天，向每个井中加入0.3毫升新鲜培养基。活细胞用台盼蓝排斥法测定，并用血细胞仪定量。
3. 动物管理
大鼠
将雌性Sprague-Dawley大鼠(250-275g)，成年雌性SD大鼠(225-250g)随机分配至治疗组或媒介物组，使得每组的平均起始体重相等。药物治疗开始于手术当天或14天停药后重新加载的第一天。雷帕霉素每天一次通过腹膜内注射以1.5mg / kg的剂量递送，溶解在2%羧甲基纤维素中。 CsA每天一次通过皮下注射以15mg / kg的剂量递送，溶于10%甲醇和橄榄油中。 FK506每天一次通过皮下注射以3mg / kg的剂量递送，溶于10%乙醇，10%的cremophor和盐水中。
小鼠
将雷帕霉素以20mg / mL的浓度溶解在乙醇中，过滤灭菌，以1mg / mL的浓度重悬浮于载体(0.25%PEG，0.25%吐温-80)中，并腹膜内注射。(2mg / kg体重)，每天持续4周或每天持续4周，然后每周注射另外4周。注射开始于8周(肥大发作前)或12周(指示确定肥大后)，并在治疗4周后或治疗8周后评估小鼠，详见结果和图例。 作为对照，WT和LS / +小鼠仅用载体处理。